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      分子實(shí)驗-免疫熒光基本實(shí)驗步驟(基本步驟與技巧)

      發(fā)布時(shí)間: 2023-03-20  點(diǎn)擊次數: 1680次

      分子實(shí)驗-免疫熒光基本實(shí)驗步驟(基本步驟與技巧)

        免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎上建立起來(lái)的一項技術(shù)。它是根據抗原抗體反應的原理,先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原(或抗體)。利用熒光顯微鏡可以看見(jiàn)熒光所在的細胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位,以及利用定量技術(shù)(比如流式細胞儀)測定含量。

        免疫熒光實(shí)驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透(或稱(chēng)為透化)、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備(通俗的說(shuō)法是細胞爬片)是免疫熒光實(shí)驗的第一步,細胞片的質(zhì)量對實(shí)驗的成敗至關(guān)重要,原因很簡(jiǎn)單,如果發(fā)生細胞掉片,一切都無(wú)從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片的處理以及細胞的活力,有人根據成功經(jīng)驗總結出許多有益的細節或小竅門(mén),非常值得借鑒。固定和通透步驟最重要的是根據所研究抗原的性質(zhì)選擇適當的固定方法,合適的固定劑和固定程序對于獲得好的實(shí)驗結果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其他方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步驟是類(lèi)似的,最重要的區別在于免疫熒光實(shí)驗中要用到熒光抗體,因此必須謹記避光操作,此外,抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是,標記好熒光的細胞片應盡早觀(guān)察,或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存,以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實(shí)驗結果。

        由于操作步驟比較多,同時(shí)在分析結果時(shí)無(wú)法像WB那樣可以根據分子量的大小區分非特異性識別,所以要得到一個(gè)免疫熒光實(shí)驗結果,除了需要高質(zhì)量的抗體,以及對實(shí)驗條件進(jìn)行反復優(yōu)化外,還必須設立嚴謹的實(shí)驗對照??傊?,免疫熒光實(shí)驗從細胞樣品處理、固定、封閉、抗體孵育到最后的封片及觀(guān)察拍照,每步都非常關(guān)鍵,需要嚴格控制實(shí)驗流程中每個(gè)步驟的質(zhì)量,才能最終達到你的實(shí)驗目的。


        免疫熒光實(shí)驗基本實(shí)驗步驟:

        細胞準備

        對單層生長(cháng)細胞,在傳代培養時(shí),將細胞接種到預先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養皿中,待細胞接近長(cháng)成單層后取出蓋玻片,PBS洗兩次;對懸浮生長(cháng)細胞,取對數生長(cháng)細胞,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

        固定

        根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢后的細胞可置于含疊氮鈉的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS洗滌3*5次。

        通透

        使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細胞,一般需要在加入抗體孵育前,對細胞進(jìn)行通透處理,以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min。通透后用PBS洗滌3*5min。

        封閉

        使用封閉液對細胞進(jìn)行封閉,時(shí)間一般為30min。

        一抗結合

        室溫孵育1h或者4℃過(guò)夜。PBST漂洗3次,每次沖洗5min。

        二抗結合

        間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h。PBST漂洗3次,每次沖洗5min后,再用蒸餾水漂洗一次。

        封片及檢測

        滴加封片劑一滴,封片,熒光顯微鏡檢查。

        免疫熒光實(shí)驗步驟技巧

        封閉:

        將組織切片自-20℃冰箱取出,室溫靜置15 min(可采用免疫熒光封閉用筆在組織周?chē)?huà)圈以避免抗體擴散),隨后采用1×PBS洗三次,每次5 min,最后采用blocking buffer(綿羊血清5%,0.3%Triton-100,采用1×PBS稀釋可得)室溫封閉1 h。

        一抗孵育:

        濾紙吸掉玻片上的封閉液(吸取的時(shí)候要注意不要碰到組織樣本),并滴加blocking buffer配置的待測抗體,將玻片置于濕盒中,4℃孵育過(guò)夜。既然是濕盒,應該都知道里面要加水防止抗體蒸發(fā)的吧,嗯嗯,聰明的你們肯定知道。

        二抗孵育:

        第二天把濕盒從冰箱拿出來(lái)(一般來(lái)說(shuō)大部分的染色可直接做下面的步驟,如果待測蛋白比較難染色,可將濕盒置于室溫繼續孵育一段時(shí)間,時(shí)長(cháng)自己定),回收一抗(土豪的話(huà)就隨意),1×PBS滴加到玻片上,洗三次,每次3 min,隨后吸取多余的1×PBS。

        接下來(lái)所有的操作均在避光條件下進(jìn)行,這很重要!

        滴加二抗(同樣用blocking buffer配置哦),室溫孵育1 h。

        染核:

        吸掉二抗,滴加DAPI孵育3-5 min,1×PBS同上方法洗三次。

        最后用濾紙吸取多余的液體,用含有抗淬滅劑的封片劑封片(有小伙伴用指甲油,也行),避光保存后即可在顯微鏡下觀(guān)察染色的情況。

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