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      上皮細胞類(lèi)培養實(shí)驗

      發(fā)布時(shí)間: 2023-06-06  點(diǎn)擊次數: 411次

      實(shí)驗原理:

      利于皮膚表皮細胞實(shí)驗">培養成功的因素有,在有膠原的底物上易生長(cháng);另有人發(fā)現把人或小鼠表皮細胞培養在以3T3 細胞為飼養層(用射線(xiàn)照射后)上時(shí),細胞易生長(cháng)并可發(fā)生一定程度的分化現象。降低pH、Ca2+的含量和溫度等,均利于表皮細胞生長(cháng)。向培養基中加氫化可的松( 10 μg/ml )、10-10 的霍亂毒素、10M-6 的異丙基腎上腺素(Isopro-terenol)和10 ng/mI 促表皮生長(cháng)因子(EGF)能促表皮細胞生長(cháng)。


      方法:

      皮膚是皮表細胞培養來(lái)源,小兒包皮是皮膚表皮細胞培養的好材料。全皮培養時(shí),表皮細胞與成纖維細胞混合生長(cháng),難以純化。黑木登志夫(1981)用皮膚表皮和真皮分離培養法可獲純上皮細胞,有一定參考價(jià)值,其法如下:

       

      1.  取材

      取外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊,以角化層薄者為佳,早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮
      膚更好,切成 0.5~1 平方厘米小塊;

      2.  EDTA處理

      先置入0.02 %EDTA 中室溫置5 分鐘;

      3.  冷消化

      換入0.25 %胰蛋白酶中,置4 ℃過(guò)夜;

      4.  分離

      取出皮塊,用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開(kāi);

      5.  溫消化

      取出表皮單獨處理,用剪刀剪成更小的塊后,置入新的0.25 %胰蛋
      白酶中,37 ℃再消化30~60 分鐘;

      6.  用吸管輕輕反復吹打,使成細胞懸液;

      7.  培養液

      通過(guò)80 目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后,低速離心,吸上清,直接加入Eagle液和 20 %小牛血清,制成細胞懸液,接種入碟皿中,CO2溫箱培養。


      注意事項:

      冷消化目的在于使表皮和真皮結合松散,如冷消化后分離下來(lái)的表皮膜自身也已松散,此時(shí)亦可直接置入PBS中用吸管吹打制備細胞懸液;不再經(jīng)過(guò)第二次消化。


      其他:

      皮膚表皮培養亦可用全皮消化法或組織塊培養法培養。用膠原酶消化為好,它對結締組織有較強消化作用,對表皮細胞損傷小,但成纖維細胞易與上皮細胞同時(shí)生長(cháng),在這種情況下,需做排除成纖維胞處理。血清中含有血小板來(lái)源的生長(cháng)因子(PDGF),易促成纖維細胞的生長(cháng);如用好的、不含PDGF的無(wú)血清培養基培養可能更好。


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