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      ELISA實(shí)驗中不同類(lèi)型樣本的處理方法

      發(fā)布時(shí)間: 2023-11-21  點(diǎn)擊次數: 250次

      通常我們用ELISA來(lái)檢測的樣本是有多種類(lèi)型的,如血清、血漿、尿液、細胞培養上清或組織勻漿液等,不同類(lèi)型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和準確性的第一步。

      1、 血清

      血清是常用于ELISA檢測的一類(lèi)樣本,處理也比較簡(jiǎn)單。用無(wú)熱原、無(wú)內毒素的試管或離心管采集血液標本,將試管或離心管室溫放置2小時(shí)或4℃一個(gè)晚上,使血清析出。(最好將試管或離心管傾斜放置,使液面橫截面增大,能使血清更大程度的析出)。4℃1000×g離心20分鐘,仔細收集上清。建議將血清分裝多份,-20℃或-80℃保存,避免反復凍融。

      采血過(guò)程中應避免溶血,因為紅細胞裂解時(shí)會(huì )釋放具有過(guò)氧化酶活性的物質(zhì),在以HRP為標記的ELISA檢測中會(huì )有非特異性的顯色,而導致檢測的不準確性。同時(shí)也應避免細菌污染,因為菌體內可能含有內源性的HRP從而導致檢測的假陽(yáng)性。

      2、 血漿

      ELISA實(shí)驗用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標本,標本采集后30min內4℃1000×g離心15min,取上清即血漿。將上清分裝多份,-20℃或-80℃保存,避免反復凍融。避免使用溶血或高血脂的標本。常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等,檢測時(shí)還應仔細閱讀試劑盒說(shuō)明書(shū),檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求。

      3、 細胞培養上清

      取細胞培養上清到離心管,1000×g離心20min,除去細胞碎片及雜質(zhì),取上清,-20℃或-80℃保存,避免反復凍融。

      4、 細胞裂解液

      (1)吸去培養板內的培養基,用胰酶消化細胞,加適量培養基將細胞從培養板上吹下來(lái)。懸浮細胞可省略。

      (2)收集細胞懸液,1000×g離心10min,棄去培養基,用預冷的PBS潤洗3次。

      (3)加入適量的預冷PBS或細胞裂解液(臨用前加入蛋白酶抑制劑)重懸細胞。通常6孔板一個(gè)孔的細胞量需要150~250μL PBS重懸。

      (4)將樣品放入-20℃或-80℃,使樣品冷凍,再放室溫解凍樣品,反復凍融幾次,使細胞充分裂解。也可將樣品進(jìn)行超聲破碎,以達到裂解的目的。

      (5)4℃10000×g 離心10min,除去細胞碎片,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反復凍融。

      5、組織勻漿液

      (1)將組織樣本用PBS (0.01 [錨點(diǎn)] [錨點(diǎn)] M, PH 7.4) 沖洗,洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。

      (2)將組織塊稱(chēng)重,記錄后剪碎,碎塊應盡量小,便于勻漿得更充分。

      (3)將組織按一定的比例加入預冷的PBS(臨用前加入蛋白酶抑制劑)勻漿,勻漿時(shí)置于冰上或冰浴中。(通常按組織重量:PBS體積=1:9的比例勻漿,例如1g的組織樣本對應9mL的PBS,具體體積可根據實(shí)驗需要適當調整,檢測后計算樣品濃度時(shí)應乘以相應的稀釋倍數)

      (4)吸取勻漿液到離心管,4℃5000×g 離心5-10min,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反復凍融。

      6、 尿液、唾液等其他液體生物樣本

      1000×g離心20min,取上清即可檢測。

      總的來(lái)說(shuō),因為ELISA只能檢測可溶性蛋白的含量,所以應保證所有樣本均為澄清的液體,沉淀或懸浮物都應離心去除。為了保證檢測的準確性,保存于-20℃或-80℃的樣本最好在1-6個(gè)月內檢測;4℃保存的樣本應在1周內進(jìn)行檢測。另外,還應保證樣本不含NaN3,因為NaN3會(huì )抑制HRP的活性,從而導致假陰性的結果。 


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