細胞素信號為哺乳動(dòng)物的組織模式提供了重要的貢獻

作者 埃里克·T.霍爾，Miriam E。
    迪拉德，伊麗莎白R.克萊維登，...，
    卡門(mén)辛德·羅賓遜，
    杰弗里·斯坦伯格，史黛西K.奧格登

 函件stacey.ogden@stjude.org

 簡(jiǎn)言之在神經(jīng)管發(fā)育過(guò)程中，細胞素，特的信號傳導
絲狀偽足，有助于聲音刺猬和WNT的分散，以確保
適當的細胞命運的決定
通過(guò)腹側和背側的形態(tài)發(fā)生信號梯度。
派出
促進(jìn)聲音刺猬的內吞循環(huán)，促進(jìn)配體進(jìn)入細胞素。

亮點(diǎn)

.    發(fā)出的分裂促進(jìn)了聲音刺猬的內吞作用

循環(huán)和胞質(zhì)負載

.    細胞素有助于聲音刺猬的部署

神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中

.    肌凝蛋白10促進(jìn)神經(jīng)元細胞素的形成

SHH和WNT運輸

.    細胞素功能障礙會(huì )影響神經(jīng)元細胞的命運

規格

細胞素信號提供了必要的信號

對哺乳動(dòng)物組織模式的貢獻

埃里克T。過(guò)道1米里亞姆E。迪拉德1伊麗莎白·r·克萊弗頓1張燕1克里斯蒂娜·戴利，1Shariq S.安薩里，1

蘭德?tīng)栱f克菲爾德，2丹尼爾·斯圖爾特，1Shondra。普魯特米勒，1,3阿方索拉瓦多，1,4亞歷克斯·卡里西，1

阿曼達約翰遜，2永東王1艾瑪塞爾納，1邁克爾塔內斯，5楊桑雨，5卡門(mén)辛德·羅賓遜，2

杰弗里斯坦伯格，5還有斯泰西·k·奧格登1,6,*

1美國孟菲斯市圣猶大兒童研究醫院細胞和分子生物學(xué)系，TN 38105

2細胞成像共享資源，圣猶大兒童研究醫院，孟菲斯，TN 38105，美國

3高級基因組工程中心，圣猶大兒童研究醫院，孟菲斯，TN 38105，美國

4圣猶大兒童研究醫院兒童神經(jīng)系統疾病研究中心，孟菲斯，TN 38105，美國

5體內成像和治療中心，圣猶大兒童研究醫院，孟菲斯，TN 38105，美國

6引線(xiàn)接觸

*Correspondence: stacey.ogden@stjude.org

https://doi.org/10.1016/j.單元.2023.12.003

總結

在發(fā)育過(guò)程中，形態(tài)因子通過(guò)指示細胞的命運來(lái)塑造組織。無(wú)法直接可視化形態(tài)轉運，因此確保形態(tài)成功傳遞的分子機制仍不清楚。為了解決這個(gè)長(cháng)期存在的問(wèn)題，我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)受損的聲音刺猬（SHH）形態(tài)發(fā)生傳遞的小鼠模型，并發(fā)現內吞循環(huán)促進(jìn)SHH加載到被稱(chēng)為細胞素的信號絲狀偽足中。我們優(yōu)化了保存體內細胞素的方法，用于先進(jìn)的顯微鏡觀(guān)察，并顯示內源性SHH定位于小鼠神經(jīng)管發(fā)育過(guò)程中的細胞素。從神經(jīng)管中消耗SHH會(huì )改變神經(jīng)元細胞的命運并損害神經(jīng)發(fā)育。絲狀狀體運動(dòng)肌球蛋白10（MYO10）的突變降低了細胞素的長(cháng)度和密度，從而破壞了SHH和WNT的神經(jīng)元信號活性。這些結果表明，基于細胞素的信號轉運為哺乳動(dòng)物組織發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)發(fā)生分散提供了重要貢獻，并表明MYO10是細胞素功能的關(guān)鍵調控因子。

介紹

發(fā)育模式依賴(lài)于協(xié)調的細胞命運決定，這些決定由被稱(chēng)為形態(tài)因子的信號蛋白指導。形態(tài)因子以時(shí)間和濃度依賴(lài)的方式發(fā)揮作用，通過(guò)信號梯度誘導不同的細胞命運，從而形成復雜的器官和組織。1,2這些梯度的改變會(huì )導致發(fā)育障礙和癌癥，這強調了在發(fā)育和組織穩態(tài)過(guò)程中精確控制形態(tài)發(fā)生者的分布的必要性。3

提出的形態(tài)發(fā)生子如何達到其目標的模型包括自由和輔助擴散，胞吞，以及通過(guò)稱(chēng)為細胞素的特殊絲狀偽足直接傳遞。4實(shí)驗證據支持每一個(gè)分散過(guò)程，但控制這些運輸模式的分子機制尚未明確定義。在理解細胞素如何影響形態(tài)發(fā)生信號傳導方面的知識差距仍然非常大，因為技術(shù)上的挑戰往往阻礙了對體內結構的研究。

細胞素是一種長(cháng)、薄、動(dòng)態(tài)的細胞延伸，可以促進(jìn)直接傳遞聲音刺猬（SHH）、WNT、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、生長(cháng)因子和

在發(fā)育和組織穩態(tài)過(guò)程中的NOTCH配體。5–7關(guān)于細胞素生物學(xué)的大部分了解都源于人們對它們對果蠅翅盤(pán)、氣囊原基和卵母細胞組織和發(fā)育的貢獻的研究。8–10關(guān)于細胞素在脊椎動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中的功能的證據相對有限，但使用斑馬魚(yú)、小雞和美西螈模型的研究表明，細胞素影響原腸形成，并能促進(jìn)四肢的發(fā)育和再生。11–13在脊椎動(dòng)物神經(jīng)管等復雜組織組織中詢(xún)問(wèn)細胞素仍然不可行，因此限制了對這些結構何時(shí)何地活躍以及它們是如何被調節的理解。

為了深入了解這一重要的生物學(xué)特性，我們詢(xún)問(wèn)了SHH形態(tài)發(fā)生信號通路。3,14,15SHH具有兩種共價(jià)脂質(zhì)修飾，包括氨基端長(cháng)鏈脂肪酸和羧基端膽固醇。這兩者都是SHH信號梯度的建立所必需的，也有助于調節補?。≒TCH）受體。16–19SHH脂質(zhì)賦予成熟配體高的膜結合傾向，需要專(zhuān)門(mén)的機制來(lái)中和脂質(zhì)系結，以便從產(chǎn)生的細胞中部署。這一機制的一個(gè)重要組成部分是12通道跨膜蛋白

細胞187,1-18,2024年1月18日，ª，2023年，作者。.    1這是一篇在CC BY-NC-ND許可（http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/）.下的開(kāi)放獲取文章

已發(fā)送（DISP）。20–24DISP使用質(zhì)膜Na+梯度驅動(dòng)SHH膜提取轉移到細胞外擴散伴侶信號肽，CUB結構域和包含2的EGF樣結構域（SCUBE2）。25–29奇怪的是，對小鼠的遺傳學(xué)研究表明，SCUBE2在某些shh調控的發(fā)育過(guò)程中可能是需要的，30這表明存在獨立的、冗余的或協(xié)作的部署機制。因此，刺猬配體可以定位到從外泌體中的信號細胞中釋放出來(lái)的細胞素內的囊泡結構。31–36因為DISP定位于細胞素，36–38我們假設，除了促進(jìn)SISP促進(jìn)SCUBE2的輔助擴散外，還促進(jìn)細胞素介導的SHH轉運。控制細胞素中DISP活性的調控機制尚不清楚。

我們之前證明了在DISP的第一個(gè)細胞外環(huán)中Furin的分裂是SHH部署所必需的。39結構分析顯示，雖然二硫鍵在剪切后保留了裂解片段，但DISP的處理對于打開(kāi)其胞外結構域以實(shí)現SHH的釋放是必要的。28,29,40為了確定卵裂破壞如何影響SHH細胞素進(jìn)入和形態(tài)梯度活性，我們建立了一個(gè)DISP加工受損的敲入小鼠模型(DISPCS).我們演示了DISPCS突變小鼠改變了神經(jīng)模式、小腦功能障礙，以及由神經(jīng)元細胞素的SHH消耗導致的高圍產(chǎn)期死亡率。通過(guò)肌動(dòng)蛋白運動(dòng)肌凝蛋白10（MYO10）的丟失來(lái)破壞細胞素功能，從而獲得了SHH信號通路的類(lèi)似缺陷。36,41值得注意的是，有助于背側神經(jīng)管模式的WNT信號通路，同樣因MYO10的丟失而減少。綜上所述，我們的研究結果支持了細胞素在哺乳動(dòng)物組織形態(tài)發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并確定了MYO10是細胞素功能的調節因子。

提示跳躍表型是Disp1中SHH信號減少的特異性表現CS/INDEL而不是由小腦功能障礙引起的一般共濟失調。

研究Disp1對組織模式的影響CS/INDEL通過(guò)SHH形態(tài)梯度，我們分析了E9.5/25-30體胚胎發(fā)育的神經(jīng)管。開(kāi)始…E8.0，來(lái)自脊索的SHH信號誘導神經(jīng)管底板（FP），用叉頭盒A2（FOXA2）標記。SHH還指定了不同的腹側神經(jīng)管祖細胞結構域，由NK2 Homeobox 2（NKX2.2）、少突膠質(zhì)細胞轉錄因子2（OLIG2）和配對box 6（PAX6）標記。47這些腹側細胞命運的誘導對SHH暴露的波動(dòng)高度敏感，因此祖細胞結構域的建立可以作為SHH形態(tài)發(fā)生梯度活性的讀數。48,49已發(fā)表的研究表明，具有雜合子Disp1突變的小鼠在表型上與野生型（WT）動(dòng)物難以區分，而DISP活性的完全喪失會(huì )導致E9.5的死亡。21–23因此，演示1CS/+和顯示器1印第安納州/+胚胎表現為表型正常，具有典型的神經(jīng)管祖細胞結構域建立（圖2A-2C、2F-2H和2K-2N）。相反，顯示器1英德?tīng)?/span>缺乏功能性Disp1等位基因的突變體，在E9.5附近死亡，并出現神經(jīng)管缺陷，包括PAX6的完全腹側化和FOXA2、NKX2.2和OLIG2祖細胞結構域的丟失（圖2D、2I和2K-2N）。顯示器1CS/INDEL.   神經(jīng)管保留了足夠的SHH信號活性來(lái)誘導FP和NKX2.2和OLIG2祖結構域。然而，與對照組相比，這些結構域的大小縮小并向腹側移動(dòng)(圖2J與圖2F、2K-2Q、S2A和S2A相比0).因此，RNAscope原位雜交分析顯示，在Disp1中表達Gli1的細胞數量減少CS/INDEL與對照組相比（圖2R-2W、S2B和S2C）。RNA測序（RNA-seq）分析證實(shí)，Disp1中的神經(jīng)元分化受到損害CS/INDEL胚胎（圖S2D-S2G）。因此，在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，適當的SHH形態(tài)形成梯度活動(dòng)需要適當的DISP裂解。

結果

DISP的分裂是神經(jīng)發(fā)育所必需的

CRISPR-Cas9用于生成Disp1基因細胞外環(huán)1中Furin切割位點(diǎn)突變的敲除小鼠（圖S1A）。39這導致產(chǎn)生了目標突變等位基因(Disp1CS)和一個(gè)敲除基因功能的11個(gè)堿基對缺失突變體(Disp1英德?tīng)?/span>，圖S1A)。雜合子Disp1CS/+小鼠表型正常，而Disp1CS/CS突變體有不同的腦積水（圖S1B和S1C）。因此，演示1CS可能作為一個(gè)畸形等位基因，降低但不減弱DISP活性。因此，通過(guò)結合Disp1，進(jìn)一步減少了Disp1基因的劑量CS和顯示器1英德?tīng)?/span>反式的等位基因導致了高滲透率和嚴重的表型。大多數Disp1CS/INDEL幼崽在出生后1周內死亡，存活的動(dòng)物會(huì )逃跑，無(wú)法茁壯成長(cháng)（圖1A-1C和S1D）。存活下來(lái)的磁盤(pán)1CS/INDEL小鼠表現為腦積水，顱骨大小縮小，眶間距離縮小，頜骨縮短，小腦體積減少(圖1D-1F0和S1E-S1G0)，表明在發(fā)育過(guò)程中SHH信號通路減少。42–44值得注意的是，97%的存活的Disp1CS/INDEL小鼠（n = 38/39）在6周齡時(shí)出現了跳躍性步態(tài)共濟失調（圖1G-1I0；視頻S1)。跳躍步態(tài)可能是由于shh指定的神經(jīng)祖細胞的消耗，45,46sug-

DISP的內吞作用被分裂破壞而改變

在果蠅中，從極化的上皮細胞中部署Hh需要disp介導的內化和內吞循環(huán)。37,50為了測試DISP是否在哺乳動(dòng)物細胞中發(fā)生了再循環(huán)，我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)體外系統來(lái)詢(xún)問(wèn)DISP在極化、多細胞球狀體中的運輸。小鼠髓內收集管（IMCD3）細胞在3D培養中極化并可形成多細胞球狀體，51用編碼WT或CSV5-disp-血凝素（HA）蛋白和強力霉素誘導的SHH的載體轉導(圖3A-3G、S3A和S3A0).IMCD3細胞在Matrigel中培養，促進(jìn)其組織成具有根尖腔的球狀體（圖3A-3E）。V5和HA表位標簽之間的信號重疊用于追蹤未切割的DISPCS和處理DISP重量其二硫鍵栓在氨基末端。28,29無(wú)SHH，DISP重量本地化更基礎，而DISPCS沿著(zhù)細胞膜均勻分布(圖3a0和3c0).在強力霉素誘導后，SHH在根尖腔和細胞膜上積累，以及DISP重量

2細胞187,1-18,2024年1月18日

圖1. DISP裂解中斷引發(fā)發(fā)育缺陷

（Aand B）男性和女性Disp1CS/INDEL小鼠體型縮小(n=5-17只小鼠/基因型）。P35雌性小鼠顯示在(A).中

(C) A Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)顯示Disp1的生存能力降低CS/INDEL老鼠從P0到P35，每周監測16窩。

（D和E) Disp1CS/INDEL小鼠有腦積水和顱面缺陷。

(E)Disp1的計算機斷層掃描（CT）掃描CS/INDEL顱骨顯示寬長(cháng)比擴大，眶間間距減少，頜骨長(cháng)度減少（n=10-12只小鼠/基因型）。

(Fand F0) Disp1CS/INDEL小鼠的小腦也很?。ǚ嚼ㄌ枺?。在P0、P22和P55時(shí)計算小腦體積相對于總腦體積。每種基因型至少分析4只小鼠。

(G–I0) Disp1CS/INDEL老鼠的步態(tài)跳躍。（Hand I）前肢（藍色）和后肢（紅色）跟蹤肢體位置和量化步態(tài)比率。計算5只小鼠/基因型的步態(tài)比例，并合并雄性和雌性數據。所有數據均以平均± SD，*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001表示。請參見(jiàn)圖S1和視頻S1。

沿著(zhù)基底外側膜均勻富集(圖3b0、3F和3G)。磁盤(pán)CS在SHH誘導后，根尖基底分布沒(méi)有變化(圖3D0，3F和3G)，表明Furin的切割啟動(dòng)了shh刺激的極化上皮細胞的膜再分配。

為了確定shh刺激的DISP膜再分配發(fā)生的分子機制，我們在Disp1中穩定表達了V5-DISP-HA蛋白-/-分配科)小鼠胚胎成纖維細胞（mef）。這就允許對DISP進(jìn)行檢查

在沒(méi)有內源性的背景下的膜運輸

可能影響DISP的DISP蛋白CS循環(huán)通過(guò)

低聚物關(guān)聯(lián)。39,52細胞表面生物素化和環(huán)素化

己酰亞胺處理實(shí)驗證實(shí)了DISP重量和

磁盤(pán)CS蛋白質(zhì)具有相似的細胞表面表達和

降解動(dòng)力學(xué)，表明裂解破壞有

不顯著(zhù)降低DISP蛋白的穩定性或限制其mem-

膜訪(fǎng)問(wèn)(圖S3B、S3C0和S3N)。探測SHH-

誘導DISP膜循環(huán)的變化，我們進(jìn)行了

細胞187,1-18,2024年1月18日3

圖2。DISP卵裂破壞改變了神經(jīng)管模式

（A-E）指示基因型的E9.5/27-29體細胞胚胎顯示。

（F-J）對E9.5/27-29體細胞胚胎發(fā)育中的神經(jīng)管的心臟水平切片進(jìn)行FP和腹側祖細胞標記物的染色。DAPI標記核。星號表示FOXA2在脊索和前腸中的表達(I)。

（下頁(yè)繼續圖例）

4細胞187,1-18,2024年1月18日

免疫熒光共定位分析并計算DISP與內吞標記蛋白適配器蛋白2a（AP2）、網(wǎng)格蛋白、洞穴蛋白、Rab4、Rab5、Rab7和Rab11之間的Pearson相關(guān)系數(圖3H和3H0).53而DISP重量和DISPCS在沒(méi)有SHH的情況下，蛋白表現出與AP2相似的共定位水平，而SHH的表達存在差異。在表達SHH的細胞中，DISP重量與AP2的共定位增加，而DISP則增加CS-AP2的共定位保持不變(圖3H0和S3D-S3G)。在DISP之間也觀(guān)察到shh誘導的共定位增加重量以及網(wǎng)格蛋白、Rab4、Rab5、Rab7和Rab11(圖3H0和S3H-S3M)，表明DISP重量與SHH的相互作用增強了內吞循環(huán)。磁盤(pán)CS循環(huán)核內體的富集對配體的反應沒(méi)有增加。然而，它比DISP略豐富重量在沒(méi)有SHH的情況下，腸黃素、Rab5、Rab7和Rab11標記的內吞室(圖3H0和S3H-S3M)。

DISP與洞穴蛋白的共定位均未被切割位點(diǎn)突變或SHH的表達所改變，這表明網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用是SHH刺激的DISP內吞循環(huán)的主要途徑(圖3H0).因此，我們在DISP的胞內羧基端尾部確定了AP2網(wǎng)格蛋白適配器復合物的四個(gè)推測的雙亮氨酸結合基序（圖3I）。為了確定這些基序是否有助于shh刺激的再循環(huán)，我們生成了一個(gè)缺失所有四個(gè)基序的羧基末端缺失突變體(DISPΔC)和一個(gè)將這四個(gè)基序突變?yōu)楸彼岬耐蛔凅w(DISP4xAA).兩個(gè)DISPΔC和DISP4xAA到達細胞表面，并被Furin有效地處理，這可以通過(guò)細胞表面的生物素化和V5裂解片段的產(chǎn)生來(lái)證明（圖S3N）。重要的是，ΔC和4xAA突變體在生物素化質(zhì)膜組分中均表現出高于DISP的富集重量和DISPCS，與促進(jìn)DISP內吞作用的ap2結合位點(diǎn)一致（圖S3N）。磁盤(pán)ΔC質(zhì)膜富集比DISP更明顯4xAA，表明羧基末端片段中的一個(gè)額外的基序可能有助于膜的內化。因此，我們專(zhuān)注于DISPΔC為進(jìn)一步分析?？赡苁怯捎谠贒ISP之間觀(guān)察到的基線(xiàn)共定位適度升高CS和內吞機制，DISPCS其細胞表面定位率低于DISP重量（圖3H0和S3N)。

為了進(jìn)一步探索這一機制，我們檢測了Furin的切割是否影響了DISP-AP2的結合。V5-DISP-HA蛋白在表達shh的Disp中表達科我們進(jìn)行了mef實(shí)驗和共免疫共沉淀實(shí)驗。與DISP通過(guò)網(wǎng)格蛋白/ap2依賴(lài)的機制內化相一致，a和β-適配蛋白蛋白均存在于與DISP的抗ha共免疫沉淀中重量（圖3J，第5車(chē)道）。第2頁(yè)

在兩個(gè)V5-DISP中的適配器亞基都減少了CS-HA和V5DISPΔC-HA共免疫沉淀（圖3J，6-7通道），支持DISP通過(guò)一個(gè)或多個(gè)已鑒定的羧基末端結合基序結合sAP2，Furin切割在SHH結合后通過(guò)這些位點(diǎn)增強DISP-AP2的結合。

來(lái)檢測減少的AP2結合是否改變了DISPCS或DISPΔC內化動(dòng)力學(xué)上，我們用光穩定熒光標記Dronpa3標記WT和突變體DISP蛋白54并追蹤Madin-Darby犬腎（MDCK）細胞的基線(xiàn)和shh刺激的內化。52,55為了準確地跟蹤膜的內化，我們首先使用網(wǎng)格蛋白抑制劑Pitstop 2暫停內吞作用，56然后監測Pitstop 2洗脫前后的DISP-Dronpa3質(zhì)膜信號強度(圖3K-3L0).與網(wǎng)格蛋白是DISP內化的主要途徑相一致的是，所有的DISP變體在Pitstop 2的作用下都在質(zhì)膜上積累（圖3K和3L）。Pitstop 2洗脫后，三種DISP蛋白的膜信號強度均下降，但它們的內化率差異明顯(圖3K0和3l0).根據在DISP之間觀(guān)察到的適度升高的共定位CS而內吞標記物對SHH的反應沒(méi)有改變(圖3H0), DISPCS在配體缺失和存在的情況下，以恒定的速率內化。相反，SHH的表達加速了DISP重量內部化的速度比DISP更快CS（圖3K0)，進(jìn)一步表明WT蛋白經(jīng)歷了配體刺激的內吞作用。磁盤(pán)ΔC內化的速度比DISP要慢重量在SHH的缺失和存在的情況下，證實(shí)了羧基端ap2結合基序是DISP有效內吞作用所必需的(圖3L0).結合以上實(shí)驗，這些結果表明，DISP膜的循環(huán)是通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導的內吞作用發(fā)生的，而Furin的切割增強了DISP對SHH的反應，以及配體刺激的循環(huán)內吞作用（圖3M）。

DISP突變減少了SHH細胞素的進(jìn)入

對果蠅和脊椎動(dòng)物的研究表明，Hh配體從外囊泡中產(chǎn)生的細胞中釋放出來(lái)，我們實(shí)驗室之前的工作表明，SHH和DISP定位于細胞素內的囊泡。31–33,35,36因此，我們推測DISP-SHH復合物的內吞循環(huán)可能促進(jìn)SHH囊泡富集以促進(jìn)細胞素進(jìn)入。檢測DISP的內吞循環(huán)活性CS改變了細胞素中SHH的數量，我們在Disp中穩定表達了WT或CS V5-DISPHA蛋白科mef，然后定量細胞素發(fā)生率和SHH和DISP細胞素進(jìn)入（圖4）。我們之前證明了SHH共受體的兄弟

（=-n）每個(gè)基因型分析的n3個(gè)3-5個(gè)胚胎的神經(jīng)管切片中所示的祖細胞標記物的平均表達域區域（黑點(diǎn)）?；疑狞c(diǎn)代表單獨的部分。

（O和P）以OLIG2 (O)和NKX2.2 (P)沿背側/腹側（DV）軸的平均熒光強度線(xiàn)圖顯示。從FP中線(xiàn)基面到屋頂的線(xiàn)形圖（虛線(xiàn)，插入O）。虛線(xiàn)表示掃描電鏡。n=14-18個(gè)切片。

(Q)指示的DV位置相對于神經(jīng)管長(cháng)度的箱線(xiàn)圖。腹側和背側區域的位置分別顯示在盒子的頂部和底部。n = 3個(gè)胚胎，每個(gè)胚胎有5-8個(gè)切片。FP中線(xiàn)被設置為零。

（R-V）RNAScopeGli1原位雜交在E9.5/25-30體細胞期匹配的心臟水平的神經(jīng)管切片上。Gli1探針為紅色，DAPI為藍色。

(W)從FP到屋頂板的平均Gli1信號強度圖。每個(gè)基因型有3個(gè)胚胎，每個(gè)基因型定量n個(gè)=26-30個(gè)切片。虛線(xiàn)表示半散點(diǎn)，箱線(xiàn)圖數據表示為平均± SD，**p < 0.01，****<0.01，****p < 0.0001，ns =不顯著(zhù)，見(jiàn)圖S2。. .

細胞187,1-18,2024年1月18日5

圖3。DISP的裂解促進(jìn)了shh刺激的內吞循環(huán)

(A–D0) IMCD3球狀體穩定表達DISP重量或DISPCS蛋白質(zhì)用抗v5（洋紅色）和抗ha（綠色）進(jìn)行免疫染色。F-actin在(A)和(C)中為黃色（強力霉素陰性），強力霉素誘導的SHH在(B)和(D).中為黃色DAPI是藍色的?？s放區域用虛線(xiàn)表示。箭頭表示(F)和(G)分析的區域。

（下頁(yè)繼續圖例）

6細胞187,1-18,2024年1月18日

CDON（BOC）和細胞粘附分子相關(guān)/被致癌基因（CDON下調）促進(jìn)shh產(chǎn)生細胞中細胞素的發(fā)生，而在培養的小鼠成纖維細胞中細胞素的形成不需要DISP。36因此，SHH的表達增加了細胞素的發(fā)生率，而不依賴(lài)于DISP（圖4A）。盡管它能夠促進(jìn)Disp中細胞素的發(fā)生科SHH不能有效地進(jìn)入缺乏DISP蛋白的細胞素，也不能激活與SHHDisp共培養的SHH光II膠熒光素酶報告細胞的信號科mef（圖4B、4E和S3O）。DISP蛋白在DISP中的表達科mef顯示DISP重量和DISPCS以相似的效率進(jìn)入細胞素。盡管如此，只有DISP重量顯著(zhù)增加SHH細胞素進(jìn)入，盡管水平略低于WT細胞中觀(guān)察到的水平(圖4B-4G0).類(lèi)似地，DISP重量在SHH光II細胞共培養實(shí)驗中，SHH產(chǎn)生細胞中表達比DISP表現出更高的信號活性CS（圖S3O)。因此，配體刺激的DISP-SHH復合物的內吞循環(huán)可能有助于SHH包裝成囊泡，用于細胞素裝載和/或信號轉導。

進(jìn)一步評估SHH細胞素進(jìn)入DISP的影響CS在接收細胞（RCs）中表達通路誘導的信號產(chǎn)生細胞，我們監測了shh激活的Ca2+不斷的變動(dòng)36分配科單獨表達SHH或與WT或CS DISP蛋白共同表達的mef與Ca共培養2+在細胞素接觸的報告細胞中定量報告細胞和通量率。加拿大2+通量率與SHH細胞素加載狀態(tài)相關(guān)，如DISP重量-表達細胞誘導的通量率明顯高于Disp科或DISPCS表達細胞（圖4H）。因此，DISPCS突變破壞了shh刺激的DISP內吞循環(huán)，減弱了其伴隨SHH進(jìn)入細胞素的能力，從而促進(jìn)接觸介導的信號傳導。

含shh的細胞膜存在于

神經(jīng)管

我們開(kāi)發(fā)了組織處理、固定和成像策略，以便在發(fā)育中保存和檢測細胞素。57使用這些方法，我們從產(chǎn)生shh的NCs和神經(jīng)管FPs中尋找細胞素樣延伸。一種番茄膜

使用brane-GFP（mT/mG）報告基因用GFP標記表達shh的細胞膜。58,59共聚焦顯微鏡觀(guān)察E9.5/25-30體胚胎的心臟水平切片顯示GFP陽(yáng)性膜延伸從FP細胞向鄰近的非GFP表達的細胞延伸。在分析的88%的組織切片中觀(guān)察到這些延伸（圖5A，箭頭）。GFP陽(yáng)性的FP延伸也穿過(guò)神經(jīng)管腔（NTL），接觸鄰近的非GFP標記細胞(圖5B和5B0).平均，……觀(guān)察到11個(gè)管腔延伸，表明發(fā)育中的神經(jīng)管中產(chǎn)生shh的細胞可以直接接觸靶細胞群。

為了確定神經(jīng)管延伸是否為細胞素，我們檢測了SHH和肌動(dòng)蛋白的定位。我們使用Shh在神經(jīng)管切片中驗證了抗Shh抗體染色GFP從內源性SHH啟動(dòng)子中產(chǎn)生一個(gè)內部gfp標記的、脂質(zhì)修飾的SHH蛋白的敲入等位基因。60什赫+/+, ShhGFP/+, ShhGFP/GFP胚胎用抗GFP和抗shh染色，然后用共聚焦顯微鏡分析。而Shh+/+胚胎中抗GFP和抗Shh信號之間的共定位可以忽略不計，NC和FP的信號重疊隨著(zhù)Shh的增加而增加GFP等位基因合子性（圖S4A-S4C）。由于SHH抗體在固定組織樣本中檢測SHH蛋白具有足夠的敏感性，我們通過(guò)WT胚胎的全貼裝免疫染色檢測fp衍生的延伸是否包含內源性SHH和actin（圖5C）。檢測到含有SHH斑點(diǎn)的肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性延伸從FP延伸到NTL，表明在Shh-Cre；Rosa26的NTL中觀(guān)察到GFP標記的膜延伸mT/mG胚胎很可能是細胞素(圖5B-5C0).

為了研究神經(jīng)管細胞素的運動(dòng)軌跡，采用掃描電鏡（SEM）進(jìn)行雙向觀(guān)察切片E9.5 Disp1+/+, Disp1印第安納州/+和Disp1英德?tīng)?/span>em-通過(guò)處理來(lái)暴露NC、FP和NTL內襯細胞的頂端表面（圖5D和S4D）。在對照組和Disp1中，觀(guān)察到長(cháng)而薄的細胞延伸穿過(guò)腔內細胞的頂端膜，并接觸相鄰細胞的頂端初級纖毛英德?tīng)?/span>

(E)IMCD3球體模型顯示了(F)中的分布曲線(xiàn)和頂端/基礎熒光強度比(G)的分析區域。

(F)顯示了V5-DISP-HA從基底膜到根尖膜的平均熒光強度分布曲線(xiàn)。數據歸一化為平均分布強度等于1，點(diǎn)代表細胞±SEM（n=21-29個(gè)細胞）分布的平均強度。實(shí)線(xiàn)表示整個(gè)細胞內熒光強度的綜合曲線(xiàn)。

(G)DISP中HA、V5和SHH的平均熒光強度比±SD（根尖/基礎）重量或DISPCS顯示表達球形細胞（每個(gè)條件下n=40-47個(gè)細胞）。

(H)網(wǎng)格蛋白和小泡蛋白內吞途徑的匯總圖。

(H0)DISP-HA與Disp中內吞體標記物共定位的皮爾遜相關(guān)系數值科穩定表達V5-DISP的mef重量-HA或V5-DISPCS-HA在SHH-mCherry（n=23-39細胞）或空載體對照（n=60-126細胞）的存在下。數據以帶有1的中位數（實(shí)線(xiàn)）表示st和3rd四分位數（虛線(xiàn)）。

(I)V5-DISP-HA蛋白的示意圖，其候選雙亮氨酸ap2結合基序和羧基末端缺失消除了這些位點(diǎn)。

(J)從Disp的膜組分中提取DISP-HA的免疫共沉淀科mef穩定表達SHH與V5-DISP-HA蛋白穩定表達SHH或網(wǎng)格蛋白適配器亞基的GFP對照蛋白印跡。

(K–L0)在Pitstop 2（K和L）和洗脫后的MDCK細胞單層中表達的DISP-Dronpa3蛋白(K0和L0).細胞共同表達膜-mCherry（對照）或SHH-mCherry。n=-3次實(shí)驗，每個(gè)條件下分析31-54個(gè)細胞。數據以平均± 95%置信區間表示。

(M)一個(gè)用于DISP內部化的模型。通過(guò)Furin裂解DISP促進(jìn)shh誘導的構象轉移，從而增強DISP-AP2結合網(wǎng)格蛋白介導的SHH-DISP復合物的內吞作用。裂解破壞改變了DISP的構象，以提高基礎內化和減弱shh刺激的內化。在所有實(shí)驗中，**<0.05，***p<0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns =無(wú)顯著(zhù)性。見(jiàn)圖S3。

細胞187,1-18,2024年1月18日7

圖4。DISP的裂解促進(jìn)了SHH細胞素的進(jìn)入和信號轉導

顯示(A)細胞素發(fā)生率科mef通過(guò)GFP對照（淺灰色）或SHH-GFP（深灰色）穩定表達指示的DISP蛋白。（B-D）Disp的共焦圖像科表達SHH-GFP的mef（綠色），穩定表達V5-DISP重量-HA (C，洋紅色）或V5-DISPCS-HA (D，洋紅色）如圖所示?？s放圖像顯示了在上面的面板上概述的區域。

（E和F）散點(diǎn)圖顯示了平均SHH-GFP (E)或DISP (F)細胞素/細胞體信號強度比值。

（G和G0)V5-DISP中每個(gè)細胞素的SHH-GFP與DISP-HA的相對強度的線(xiàn)性回歸模型重量-HA或V5-DISPCS-HA表達Disp科mef。

(H) NIH-3T3細胞表達R-GECO Ca2+報告基因與對照或表達Disp的Disp共培養科細胞顯示。從n個(gè)=31-41個(gè)與產(chǎn)生SHH-GFP的細胞素接觸的單個(gè)細胞中計算每分鐘的通量率科控制或DISP重量/DISPCS表達mef。數據以平均±標準差表示。對于所有圖表，顯著(zhù)性表示為**<0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001，ns =不顯著(zhù)。

胚胎（圖5E-5H）。大約50%的根尖初級纖毛通過(guò)獨立于DISP狀態(tài)的延伸進(jìn)行接觸，表明這些關(guān)聯(lián)具有功能意義（圖5H和5I）。雖然大多數細胞連接與NTL細胞的頂端膜接觸，但也觀(guān)察到連接提示了與果蠅類(lèi)似的形態(tài)發(fā)生突觸61（圖5F，綠色圓圈）。由于神經(jīng)管的復雜結構，很難識別大多數延伸的起源。然而，在細胞-細胞接觸的部位，延伸經(jīng)常出現進(jìn)入管腔（圖S4E，綠色箭頭）。因此，來(lái)自腹側FP細胞的延伸可以被追蹤到NTL，這表明它們可能在細胞-細胞連接之間傳遞（圖S4F和S4G，綠色箭頭）。與體外實(shí)驗表明DISP不需要細胞素形成一致，在所有檢測的基因型中，神經(jīng)管延伸具有相似的頂端暴露長(cháng)度和發(fā)生率（圖5G和S4H）。值得注意的是，所有基因型的細胞延伸都顯示出沿其長(cháng)度的突起

代表囊泡性貨物（圖S4F和S4G，黃色箭頭），如之前報道的果蠅和小鼠細胞培養。36,62

基于細胞素的根尖SHH傳遞

初級纖毛作為信號樞紐，富含SHH通路成分，包括受體PTCH、信號傳感器平滑（SMO）和膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因（GLI）轉錄效應因子。63,64因此，SHH頂端細胞向初級纖毛是一種快速激活通路的有效機制。因為腹側神經(jīng)管祖細胞結構域的SHH規范發(fā)生在E8.5–E9.0/8-20體細胞之間，47用共聚焦顯微鏡觀(guān)察17-20體期的WT胚胎，以檢測NTL內襯細胞的初級纖毛附近的SHH。我們在管腔內觀(guān)察到SHH，它經(jīng)常與arl13b標記的初級纖毛共定位（圖5J，箭頭）。值得注意的是，在相鄰細胞群中，46%（n = 39/84）的肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性延伸與arl13b標記的頂端初級纖毛接觸，其中含有SHH(圖5K-5K00和S4I-S4J00；視頻S2和S3)。這些

1-18,2024年1月18日

圖5。SHH定位于發(fā)育中的神經(jīng)管中的細胞素

(A–B0神經(jīng)管顯示E9.5/25-30 E9.5/25-Rosa26mT/mG晶胚在17個(gè)胚胎的69/78切片掃描中檢測到來(lái)自表達shh細胞的(A)GFP標記細胞延伸。（波段B0)GFP陽(yáng)性膜延伸從FP穿過(guò)神經(jīng)管腔接觸鄰近細胞（插圖顯示縮?。?。

(C–C0)一個(gè)3D渲染顯示了從一個(gè)Disp1的神經(jīng)管FP的延伸+/+E9.5胚胎F-actin染色(C陰影，C白色0)和抗shh(白色，箭頭在C，洋紅色為C0).圖中呈現的區域由神經(jīng)管示意圖中的虛線(xiàn)框表示。每個(gè)組織切片平均觀(guān)察到11個(gè)神經(jīng)管腔延伸，如(B)和(C)。n = 976個(gè)擴展得分橫跨32個(gè)胚胎。

(D)矢狀平分胚胎示意圖，顯示神經(jīng)管腔（NTL）、FP和脊索（NC）根尖部的表面位置。

（EandF）E9.5(E)Disp1的SEM圖像印第安納州/+(F) Disp1英德?tīng)?/span>NTL。頂端延伸（洋紅色）接觸初級纖毛（箭頭，藍色）或使細胞尖接觸（虛線(xiàn)圈）。

(G)NTL頂端延伸段長(cháng)度的散點(diǎn)圖。每個(gè)基因型檢測3個(gè)胚胎。共61個(gè)(Disp1印第安納州/+)和68(演示1英德?tīng)?/span>)擴展被測量。

(H)每次掃描中觀(guān)察到的接觸細胞延伸的纖毛的百分比。用n = 344 Disp1對每個(gè)基因型進(jìn)行4-11次掃描分析+/+, n = 684 Disp1印第安納州/+，和n = 756 Disp1英德?tīng)?/span>纖毛接觸者得分。Ns，不重要。

(H0)小提琴圖顯示了所有基因型中與初級纖毛接觸和與初級纖毛接觸的纖毛的比例。n=1784個(gè)初級纖毛和總延長(cháng)39070分。數據以帶有1的中位數（實(shí)線(xiàn)）表示st和3rd四分位數（虛線(xiàn)）。

（一）纖毛與延伸接觸處的代表性圖像。接觸延伸的纖毛呈粉紅色，不接觸延伸的纖毛呈藍色。

(J) E9.0/17–20 somite Disp1+/+神經(jīng)管免疫染色為ARL13B（綠色）和SHH（洋紅色）。箭頭表示在初級纖毛附近的SHH斑點(diǎn)。n = 10個(gè)胚胎。

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第187,1-18號細胞，2024 9年1月18日

結果與之前的報告顯示SHH一致，60這表明細胞素可以直接將SHH傳遞給纖毛PTCH受體。

為了檢測FP內表達SHH的細胞的細胞素樣延伸是否可以進(jìn)入神經(jīng)管將SHH傳遞到根尖腔，我們對對照和DISP突變E9.5胚胎的神經(jīng)管進(jìn)行了一系列阻斷faceSEM（SBFSEM）（圖5L、5M和S4K-S4M）。在所有基因型的測試中，單個(gè)片段的細胞之間存在多個(gè)膜性“水泡”(圖5L，S4K0和S4L0).當通過(guò)連續掃描映射生成體積三維重建時(shí)，氣泡連接起來(lái)，顯示出指向管腔的長(cháng)時(shí)間連續延伸（圖5M和S4M；視頻S4）。雖然FP中的高細胞密度阻止了我們將這些延伸映射到管腔內，但在矢狀神經(jīng)管切片的共聚焦和掃描電鏡圖像中觀(guān)察到的細胞素的大小和軌跡相似，表明它們是相似的結構(圖5A-5C0箭頭、S4F和S4G黑色箭頭)。因此，我們建議細胞素穿過(guò)腹側神經(jīng)管，以促進(jìn)SHH傳遞到根尖腔。

DISP增加了SHH進(jìn)入神經(jīng)元細胞素

來(lái)自NC的SHH對于FP的誘導、向體細胞傳遞信號以及周?chē)g充質(zhì)的組織至關(guān)重要。65–69因此，NC和周?chē)M織的掃描電鏡顯示，在對照組和DISP突變體胚胎中，NC、FP和間充質(zhì)細胞的膜延伸之間存在相互作用（圖6A、6C-6E、S5A和S5B；視頻S5）。E8.5 Shh-Cre的共聚焦成像；Rosa26mT/mG和E9.5 ShhGFP/+胚胎證實(shí)了其延伸為SHH、F-actin和GFP陽(yáng)性，表明它們是細胞素(圖6B-6B00和S5C-S5C”)。值得注意的是，E8.5 Shh-Cre；羅莎26mT/mG胚胎顯示GFP標記的NC延伸到shh反應的體69（圖S5C-S5C）。這些結果表明，擴展可能促進(jìn)NC和周?chē)毎褐g的通信。

為了確定SHH定位到nc衍生的細胞素是否需要DISP，SHHGFP引入對照和Disp1突變背景，用共聚焦顯微鏡檢測NC到FP的連接。在所有檢測的基因型中，從NC到FP和間充質(zhì)的多個(gè)f放線(xiàn)陽(yáng)性延伸（圖S5D-S5G）。值得注意的是，SHH存在于對照組胚胎的NC、FP和間充質(zhì)之間的細胞素中，但在Disp1的細胞素中耗盡英德?tīng)?/span>和顯示器1CS/INDEL胚胎（圖6F-6L）。我們量化了每個(gè)nc衍生的細胞中SHH斑點(diǎn)的數量E9.5 Disp1中的線(xiàn)束印第安納州/+, Disp1英德?tīng)?/span>和Disp1CS/INDEL胚胎同時(shí)使用手動(dòng)和自動(dòng)化的方法。我們發(fā)現，DISP突變基因型的細胞膜中SHH斑點(diǎn)明顯少于對照胚胎細胞素（圖6J-6L、S5H和S5I）。與這些連接相一致的是必要的-

通過(guò)nc衍生的SHH誘導FP信號轉導，Disp1的FPs中SHH蛋白水平顯著(zhù)降低英德?tīng)?/span>胚胎（圖6H和6I)。在對照組和Disp1中沿FP細胞基膜檢測到脊索來(lái)源的SHH英德?tīng)?/span>突變胚胎，表明當細胞素基運輸受損時(shí)，基礎信號仍然可以積累（圖6H和6I，箭頭）。盡管有這種積累，但在缺乏DISP活性的胚胎中，在FP中沒(méi)有檢測到SHH，這表明基礎膜配體的積累不足以強大地誘導高閾值靶基因?；谖覀兊捏w外和體內結果，我們提出DISP促進(jìn)SHH的內吞循環(huán)，將配體加載到細胞素中，進(jìn)行頂端形態(tài)傳遞，這有助于神經(jīng)管模式（圖6M）。

MYO10促進(jìn)細胞素信號傳導

肌動(dòng)蛋白運動(dòng)MYO10促進(jìn)絲狀蛋白的形成，我們的體外研究表明，它有助于培養細胞中細胞素介導的shh運輸。36,41,70因此，我們之前證明了MYO10在體內的缺失會(huì )破壞發(fā)育中的神經(jīng)管中的SHH信號。36為了探究這種表型是否源于細胞素形成的改變，我們使用了我們的細胞素優(yōu)化的組織處理方案來(lái)可視化Myo10中的細胞素m1J/m1J老鼠71我們首先分析了E8.5胚胎，其中SHH在NC中的表達明顯高于在FP中。60在這一階段，膜GFP（memGFP）信號被限制在E8.5 Shh-Cre；Rosa26mTmG胚胎(圖7A，7B0，7E和7F)。雖然在對照胚胎的NC上可見(jiàn)大量的延伸，但在Myo10的NC上檢測到的延伸很少m1J/m1J胚胎(圖7a-7b0)，表明肌動(dòng)蛋白運動(dòng)在其形成過(guò)程中的作用。

量化對照組和Myo10中神經(jīng)管延伸的長(cháng)度和發(fā)生率m1J/m1J利用貓女軟件對E9.5胚胎的SBF-SEM數據集進(jìn)行了注釋。72這表明Myo10m1J/m1J與對照組相比，神經(jīng)管的延伸更少，現有延伸的平均長(cháng)度相對較短（圖7C、7D和S6A-S6E；視頻S6）。這種缺失與Olig2表達模式的改變相關(guān)，從Myo10的完全缺失到Olig2明顯的腹側移位m1J/m1JE8.5/10-13個(gè)體細胞胚胎(圖7A0對抗7B0和7e-7g)。這種轉變表明了高水平SHH信號通路的減少，這通常限制了Olig2從直接鄰近FP的細胞中發(fā)出。47,73在Disp1中也觀(guān)察到類(lèi)似的Olig2表達模式的改變CS/INDEL在E8.5/10-13體細胞上的胚胎，支持了類(lèi)似的功能缺陷是由降低細胞素密度(Myo10m1J/m1J)或消耗其SHH(Disp1CS/INDEL)（圖S6F-S6H）。這與myo10促進(jìn)的細胞素在腹側細胞命運決定的早期階段促進(jìn)SHH運輸相一致，

(K–K00)一個(gè)Disp1的三維渲染+/+腹側神經(jīng)管有兩個(gè)方向。一個(gè)來(lái)自FP的F-actin（白色）標記的延伸（黃色箭頭）和SHH（洋紅色）與接收細胞（RC，藍色箭頭）標記的ARL13B（綠色）接觸。黃色虛線(xiàn)表示FP和RC的劃分。所渲染的區域由虛線(xiàn)框表示。

(L)E9.5Disp1的單個(gè)SBF-SEM部分+/+神經(jīng)管FP顯示細胞間間隙，包含孤立的水泡（藍色，inseti）和部分延伸（插圖ii）。(M)三維重建的兩個(gè)細胞的膜延伸。散點(diǎn)圖用平均±標準差表示。請參見(jiàn)圖S4和視頻S3和S4。

10細胞187,1-18,2024年1月18日

E8.5 Myo10的NTL耗盡了SHH信號m1J/m1J胚胎(圖7e00與圖7F相比00，7H和7I)。因此，我們認為MYO10是體內細胞素功能和SHH信號通路的重要調節因子。

在背側神經(jīng)管模式形成過(guò)程中，WNT和bmp在頂板上產(chǎn)生信號，與NC和fp衍生的SHH相反。74–76與之前的報道一致，即WNT和BMP家族成員都沿著(zhù)細胞素運輸，13,77我們觀(guān)察到肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性延伸從頂板延伸到背側NTL（圖S6I）。為了探究背側細胞素是否有助于WNT和/或BMP在神經(jīng)管中的運輸，我們首先進(jìn)行了體外細胞素發(fā)生試驗，以確定MYO10是否影響WNT或BMP細胞素的形成。我們量化了對照組和Myo10中的細胞素發(fā)生率-/-在沒(méi)有或存在SHH-GFP、BMP2-GFP、bmp4-橙色熒光蛋白（OFP）、BMP7-GFP和WNT1-GFP時(shí)的mef。36而B(niǎo)MP2、BMP4或BMP7熒光蛋白的表達并沒(méi)有顯著(zhù)改變細胞素的發(fā)生率，而SHH-GFP和WNT1-GFP在WTmef中均有所增加，其發(fā)生率具有統計學(xué)意義（圖S6J，淺灰色）。SHH-GFP和WNT1GFP均未增加Myo10中細胞素的發(fā)生-/-除了促進(jìn)SHH細胞素的形成外，MYO10也是WNT細胞素形成的調節因子（圖S6J，深灰色）。

評估MYO10缺失對體內、對照組和MYO10神經(jīng)管WNT信號的影響m1J/m1J檢測E9.5/25-30體細胞胚胎，以評估WNT靶點(diǎn)Olig3的表達。MYO10缺失降低了OLIG3的背側表達域（圖7J-7M）。與體外實(shí)驗結果一致，MYO10的缺失不影響bmp表達細胞的細胞素，bmp誘導的磷酸化SMAD（pSMAD）的背側富集不受影響m1J/m1J神經(jīng)管（圖7N-7Q和S6J)。值得注意的是，E8.5 Myo10的RNA-seq分析+/+和Myo10m1J/m1J胚胎實(shí)驗結果顯示，在MYO10缺失后，SHH和WNT通路均被減弱，而B(niǎo)MP信號通路沒(méi)有明顯改變（圖S7）。有趣的是，NOTCH信號可以通過(guò)環(huán)境依賴(lài)的細胞素運輸發(fā)生，7在Myo10中也被確定為減少了嗎m1J/m1J胚胎(圖S7D和S7D00).綜上所述，這些結果表明

MYO10是細胞素功能的一般調節因子，除了基于擴散的信號分散機制外，基于細胞素的轉運有助于WNT和SHH介導的神經(jīng)管發(fā)育模式。

討論

DISP的裂解促進(jìn)了shh刺激的內吞作用

再循環(huán)

自從我們最初的報告強調了DISP裂解對SHH部署的重要性以來(lái)，多個(gè)DISP結構已經(jīng)被解決。28,29,39,40,78結構證據表明，裂解片段仍然緊密相連，但剪切打開(kāi)了DISP的胞外結構域，以適應SHH的結合。28,29,40,78我們新的細胞生物學(xué)實(shí)驗表明，DISP的裂解增強了對shh刺激的ap2依賴(lài)的內吞循環(huán)的反應性。因此，我們認為DISP的切割穩定了一種蛋白質(zhì)的構象，該構象轉向“打開(kāi)”的細胞內尾巴，以便在SHH結合時(shí)與AP2緊密結合（圖3M）。我們推測Furin的裂解破壞改變了DISP的構象，使它與AP2以中間親和力相互作用，以構成中層內吞循環(huán)。因為DISP的胞內結構域不能解決無(wú)脊椎動(dòng)物的DISP低溫電子顯微鏡（cryo-EM）結構，28,29,40我們不能明確地得出結論，SHH誘導構象變化，從而影響ap2結合位點(diǎn)。然而，細胞生物學(xué)分析揭示了DISP之間的一個(gè)關(guān)鍵的功能差異重量和DISPCS蛋白質(zhì)是DISP的能力重量在信號產(chǎn)生的細胞中通過(guò)SHH進(jìn)行增強的再循環(huán)。

細胞素在神經(jīng)管過(guò)程中運輸形態(tài)因子

圖案裝飾

在小鼠中，nc衍生的dSHH信號到腹側神經(jīng)管，在E8.0左右開(kāi)始指示腹側命運。通過(guò)E9.5，Shh在FP中被誘導表達，FP在NC開(kāi)始回歸后作為神經(jīng)管Shh的次要來(lái)源。60大多數腹側命運是由E8.5確定的，這表明初始模式信息是通過(guò)nc衍生的信號傳遞的。60,66然而，脂質(zhì)修飾的SHH從NC、后經(jīng)FP、andintotheapicalneuraltubehaveremainedundefined.優(yōu)化的組織處理和成像的發(fā)展

圖6。含shh的細胞素連接脊索、神經(jīng)管FP和周?chē)拈g充質(zhì)

E9.5 Disp1的(A)掃描電鏡印第安納州/+胚胎顯示脊索（NC）和間充質(zhì)。nc衍生的延伸（洋紅色）延伸到間充質(zhì)細胞的延伸（藍色）。

(B–B00) E9.5 ShhGFP/+;Disp1印第安納州/+胚胎染色為SHH（洋紅）、f-actin（綠色）和DAPI（藍色）。SHH點(diǎn)（B0在f-actin陽(yáng)性(B00)在間充質(zhì)和NC之間的延伸。頂部為FP，左側為間充質(zhì)細胞，右側為NC。

（C-E）單個(gè)NC細胞（藍色）的三維體積渲染，與間充質(zhì)細胞（黃色）的延伸接觸延伸。同樣的細胞會(huì )延伸到神經(jīng)管FP的基面（D中顯示的單個(gè)切片，E中顯示的3D體積渲染）。參見(jiàn)圖S5A和S5B和視頻S5。

(F–G0)對來(lái)自上述基因型的E9.5/27-29體細胞胚胎進(jìn)行抗GFP（綠色）、抗shh（洋紅色）和DAPI（藍色）的免疫染色。在NC和FP (F0和G0，黃色箭頭)。

(H)來(lái)自NC（箭頭）的抗Shh陽(yáng)性延伸物接觸到Shh中表達Shh的神經(jīng)管FP邊緣附近的細胞基底表面GFP/+; Disp1印第安納州/+E9.5胚胎。

(I)沿著(zhù)a Shh的基面檢測到SHH信號GFP/+;Disp1英德?tīng)?/span>神經(jīng)管（箭頭），但FP中的信號減少。

（Jand K）抗Shh斑點(diǎn)（洋紅色，箭頭）在Shh中NC和FP之間的F-actin陽(yáng)性（綠色）延伸上GFP/+;Disp1印第安納州/+胚胎(J)。在SHH中，NC和FP之間的連接中很少有明顯的SHH斑點(diǎn)GFP/+;Disp1英德?tīng)?/span>胚胎(K)。

(L)對Shh的脊索-fp細胞素中平均抗Shh斑點(diǎn)面積的散點(diǎn)圖GFP/+;Disp1印第安納州/+, Disp1CS/INDEL和Disp1英德?tīng)?/span>胚胎切片。每個(gè)基因型至少有2個(gè)胚胎，每個(gè)基因型有9-15個(gè)切片。數據以平均±標準差表示。**p <為0.01，ns，不顯著(zhù)。(M)內吞作用如何促進(jìn)DISP-SHH進(jìn)入細胞素的模型。WT和裂解缺陷的DISP蛋白都能進(jìn)入細胞素，但只有WT的DISP能有效地將SHH轉運到細胞素中。見(jiàn)圖S5。

12細胞187,1-18,2024年1月18日

圖7.肌球蛋白10促進(jìn)體內細胞素形成和SHH和WNT信號傳導

(A–B0)腹側神經(jīng)管和深度陰影鼻弦延伸（箭頭）從E8.5/10體SHH-Cre；Rosa26mT/mGMyo10+/+（A和A0)和Myo10m1J/m1J（B波段0. 胚胎的和弦是綠色的0）和（B0). (A0和B0)組織染色為OLIG2（黃色）、F-actin（洋紅色）、anti-GFP（綠色）和DAPI（青色）。每個(gè)基因型分析n=4-6個(gè)胚胎。

（CandD）散點(diǎn)圖顯示每個(gè)核(C)的延伸和延伸長(cháng)度(D)，從4個(gè)Myo10個(gè)體的E9.5神經(jīng)管FPs的SBF-SEM中定量+/+和2 Myo10m1J/m1J每個(gè)胚胎有2個(gè)掃描序列。大的點(diǎn)/三角形代表個(gè)人掃描系列。小的標記表示各個(gè)部分。(E–F ") E8.5/14 somite SHH-Cre; Rosa26mT/mG(E) Myo10+/m1J和(F) Myo10m1J/m1J脊索和神經(jīng)管切片，包括SHH（品紅）、OLIG2（黃色）、F-actin（紅色）、GFP（綠色）和DAPI（藍色）。Myo10+/m1J胚胎表現出脊索來(lái)源的延伸(E0和神經(jīng)管發(fā)光的發(fā)光斑點(diǎn)(E00，放大箭頭)。

(G)E8.5/10-15體細胞Myo10中正常、腹側移位或OLIG2缺失的組織切片的比例+/m1J（n = 8）和Myo10m1J/m1J（n = 3）胚胎顯示。每個(gè)胚胎分析3-6個(gè)切片，誤差條= SD。

（H和I）定量顯示神經(jīng)管腔內的SHH斑點(diǎn)(H)和穿過(guò)管腔根尖表面的SHH信號強度(I)。大的點(diǎn)/三角形代表單個(gè)的胚胎。半透明標記表示單個(gè)部分。在10-15個(gè)體細胞階段，每個(gè)基因型有n=6-8個(gè)胚胎。

（下頁(yè)繼續圖例）

細胞187,1-18,2024年1月18日13

在觀(guān)察小鼠胚胎組織中的長(cháng)絲狀偽足的方案，使我們能夠驗證細胞素參與了這種運輸的假設。我們觀(guān)察了NC和FP細胞素中的SHH，并提出了信號梯度建立過(guò)程中絲狀導管的SHH（圖7R）。與這一假設相一致的是，絲狀肌動(dòng)蛋白運動(dòng)MYO10的丟失減少了NC和FP延伸的形成，并破壞了腹側神經(jīng)管中的SHH信號。值得注意的是，基因和RNA-seq數據表明，MYO10mutantshavereducedsignalingbyadditionalcytoneme貨物蛋白WNT和NOTCH，提示MYO10在促進(jìn)基于細胞素的形態(tài)發(fā)生運輸中的一般作用。這種功能為Myo10的神經(jīng)表型提供了一個(gè)潛在的解釋m1J/m1J小鼠從SHH信號梯度的壓縮到嚴重的外腦畸形，這可能是由于WNT通路活性的破壞。36,71,79

細胞素有助于頂端SHH的傳遞

盡管實(shí)驗支持脊椎動(dòng)物神經(jīng)管中頂端SHH信號梯度，但刺猬信號是被極化上皮細胞接收的問(wèn)題仍然是一個(gè)激烈爭論的話(huà)題。32,35,37,50大多數在缺乏初級纖毛的果蠅翅盤(pán)上皮細胞上進(jìn)行的研究表明，長(cháng)程Hh信號在基礎上積累。31,32,37在斑馬魚(yú)中，SHH積累在發(fā)育中的視杯細胞的基底膜上，細胞過(guò)表達SHH共受體CDON。80然而，在小鼠中，SHH僅在初始模式信息傳遞后的發(fā)育后期被檢測到，并在信號-rcs的基底外側膜上被誘導表達。60我們對神經(jīng)管SHH分布的研究顯示，在E8.5和E9.5胚胎中，FP細胞沿FP細胞基膜，但該信號不能有效誘導DISP突變體中的FP。這可能是因為，無(wú)脊椎動(dòng)物，頂端初級纖毛是SHH通路控制的關(guān)鍵部位。81纖毛膜上的PTCH通過(guò)限制SMO激活甾醇的膜積累來(lái)調節纖毛SMO。82–85這使得PTCH的纖毛定位池成為SHH必須獲得快速激活smo的必要部分。因此，我們傾向于在形態(tài)形成梯度建立過(guò)程中，SHH被神經(jīng)上皮細胞在頂端接收以激活信號的模型。我們推測，在神經(jīng)管成熟過(guò)程中，SHH的纖毛SMO積累有助于增強腹側細胞的命運。這種強化可能是必要的，因為目標細胞對SHH梯度的反應在整個(gè)腹側神經(jīng)管模式中保持動(dòng)態(tài)的。66

我們預計，除了促進(jìn)NC到FP的通信外，細胞素也促進(jìn)了細胞素之間的通信

NC和間充質(zhì)形成椎間盤(pán)髓核。67,68因此，我們觀(guān)察到nc衍生的含shh延伸接觸鄰近的間充質(zhì)細胞并向體延伸。這些結果表明，細胞素從發(fā)育組織中心延伸出來(lái)，以促進(jìn)與多個(gè)反應細胞群的同時(shí)通信，從而在早期發(fā)育過(guò)程中協(xié)調多組織模式。

直接交付與擴散

如果產(chǎn)生SHH的細胞使用細胞素將形態(tài)因子傳遞到反應細胞，擴散起什么作用，細胞外SHH伴侶SCUBE2的具體作用是什么？生化和遺傳學(xué)研究表明，SCUBE2保護SHH脂質(zhì)修飾從細胞外環(huán)境，以伴侶輔助擴散。26,27然而，在Scube2中，神經(jīng)發(fā)育并沒(méi)有被報道受到損害-/-老鼠30表明與其他SHH運輸機制存在冗余。我們假設細胞素可能提供這種冗余和/或協(xié)同的轉運功能，這是由這些不同的轉運機制對DISP細胞內尾部的不同要求所表明的。結果表明，羧基末端尾部對于shh細胞循環(huán)和細胞素進(jìn)入是不能缺少的。相反，已發(fā)表的研究表明，尾巴對于disp介導的SHH轉移到SCUBE2是不可缺少的。28因此，在擴散和基于細胞素的轉運過(guò)程之間可能會(huì )發(fā)生合作和/或代償活動(dòng)，以確保在發(fā)育過(guò)程中適當的信號分散。

研究的局限性

為本研究?jì)?yōu)化的成像方案代表了可視化發(fā)育組織中形態(tài)運輸的重要技術(shù)進(jìn)展。然而，由于組織深度、大小和神經(jīng)管組織的技術(shù)限制，目前我們無(wú)法進(jìn)行相關(guān)光電子顯微鏡或通過(guò)組織中的實(shí)時(shí)成像監測SHH從NC和神經(jīng)管通過(guò)細胞素的運輸。因此，我們還不知道體內細胞素是如何連接的，它們有多穩定，它們是否通過(guò)緊密連接獲得頂端纖毛，它們追蹤SHH信號梯度的距離，以及它們的長(cháng)度是否與梯度步驟相關(guān)。未來(lái)的研究將集中于增強組織處理和蛋白質(zhì)標記，以?xún)?yōu)化具有挑戰性的成像實(shí)驗，可用于生成發(fā)育胚胎的細胞素通信網(wǎng)絡(luò )的高分辨率圖。

（J-Q）MYO10缺失會(huì )損害背側神經(jīng)管WNT信號通路。E9.5/25–30 somite Myo10+/m1J和Myo10m1J/m1J神經(jīng)管切片染色為OLIG3（紅色）（J和K）或pSMAD（紅色）（N和O），用DAPI（藍色）。

（LandP）4個(gè)對照的平均表達域區域(2 Myo10+/+和2 Myo10+/m1J)和4 Myo10m1J/m1J體細胞階段匹配的胚胎。大的點(diǎn)/三角形代表單個(gè)的胚胎。小的標記表示各個(gè)部分。所有散點(diǎn)圖數據均以平均±標準差表示。

（MandQ）OLIG3(M)和pSMAD (Q)沿背側/腹側（DV）軸的平均熒光強度線(xiàn)圖顯示。虛線(xiàn)表示SEM。n=21-25個(gè)基因型4個(gè)胚胎的25個(gè)切片。請參見(jiàn)圖S6和圖S7。

(R)神經(jīng)管中基于細胞素的信號傳輸模型。細胞素協(xié)助部署來(lái)自屋頂板的WNT（藍色）和來(lái)自脊索和FP的SHH（綠色）?；诩毎氐霓D運可能與SCUBE2輔助的SHH擴散（品紅色/綠色管腔復合物）和WNT的自由擴散（藍點(diǎn)）合作，以完善或增強神經(jīng)管發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)發(fā)生信號梯度。

14細胞187,1-18,2024年1月18日

具體方法見(jiàn)本文在線(xiàn)版，包括：

.  關(guān)鍵資源表

.  資源可用性

B鉛接觸

B材料可用性

B數據和代碼的可用性

.  實(shí)驗模型和研究參與者的細節

B小鼠

B細胞系和培養條件

.  方法詳細信息

B Disp小鼠生成

B磁共振成像

B計算機斷層掃描

B步態(tài)分析

B神經(jīng)管成像

B小鼠胚胎中細胞素的保存和成像

B細胞培養中細胞素的保存和分析

BSHH斑點(diǎn)的分析

脊索和神經(jīng)管腔

B RNA測序

B細胞培養的免疫熒光和圖像采集

B圖像處理與分析

B質(zhì)粒

B蛋白穩定性環(huán)己酰亞胺測定法

B免疫印跡和免疫共沉淀

B球狀體的生成與分析

B共定位分析

B DISP膜內化

B熒光素酶報告分析

B掃描電鏡和定量

.  B連續塊面掃描電鏡定量與統計分析

補充信息

補充信息可以在https://doi.org/10.1016/j.cell網(wǎng)站上找到。2023.12.003.

確認

蒂莫西·桑德斯和哈立德·凱毛里在圖像采集和分析方面進(jìn)行了咨詢(xún)。馬克·哈特利提供了對手稿的評論。rna測序是在SJCRH的哈特韋爾中心進(jìn)行的。SBF-SEM數據傳輸由SJCRH的生物圖像信息學(xué)中心（CBI）進(jìn)行。圣城。Jude轉基因核心（TCU）生成了Disp1突變體小鼠系。P.海灘和A。薩利克提供的Disp科mef和發(fā)育研究雜交瘤庫提供了抗體。資助項目：該研究由NIH R35GM122546（to S.K.O.）資助，F31HD110256（至C.A.D.），NCI P30CA021765（SJCRH癌癥中心支持基金）和ALSAC的St。裘德兒童研究醫院。該內容僅由作者負責，并不一定反映資助機構的觀(guān)點(diǎn)。

作者貢獻

概念化，E.T.H.，E.R.C.，M.E.D.，Y.Z.，和S.K.O.；方法論，E.T.H.，E.R.C.，M.E.D.，Y.Z.，R.W.，C.G.R.,C.A.D., S.M.P.-M., Y.-D.W.,D.P.S., E.S.,A.L.和J.S.；軟件，E.T.H.，Y。-D.W.，和A.F.C.；驗證，E.T.H.，E.R.C.，和D.P.S.；形式分析，E.T.H.，Y。Z., S.S.A., Y.-D.W.和J.S.；調查，E.T.H.，E.R.C.，M.E.D.，Y.Z.，R.W.，C.A.D., D.P.S., Y.-D.W.，M.T.，Y.S.R.，J.S.，E.S.，和A.J.；寫(xiě)作，E.T.H.，e.r.r.c.，M.E.D.，Y.Z.，C.G.R., S.M.P.-M., S.S.A., Y.-D.W.，J.S.，和S.K.O.；可視化，E.T.H.，E.R.C.，S.S.A.，和S.K.O.；監督，C.G.R.，S.M.P.-M.和S.K.O.；以及資金收購，S.K.O.

利益聲明

作者聲明沒(méi)有任何相互競爭的利益。

收稿日期：2022年7月26日

修訂日期：2023年9月6日

接受時(shí)間：2023年12月1日

出版：2024年1月2日

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18號細胞187,1-18,2024年1月18日

關(guān)鍵資源表

（在下一頁(yè)繼續）

細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日e1

小家鼠：神經(jīng)-2a ATCC RRID： CVCL_0470

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e2細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日

（在下一頁(yè)繼續）

細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日e3

Partek基因組學(xué)套件（v7.0）。RRID: SCR_011860 http://www.帕爾特克。com/?q=partekgs

資源可用性

引線(xiàn)接觸

進(jìn)一步的資源和試劑的信息和要求應直接聯(lián)系主要聯(lián)系人Stacey Ogden（stacey.ogden@ stjude.org）。

材料可用性

根據完成機構材料轉讓協(xié)議，可提供本研究中產(chǎn)生的試劑。蛋白表達載體將存放在A(yíng)ddgene上。

數據和代碼可用性

.大量RNA測序數據已存儲在基因表達綜合數據庫中，并可在https://www上公開(kāi)獲得。關(guān)鍵資源表中列出的登錄號GSE242161下的ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi。報告的所有數據

在本文中，領(lǐng)導聯(lián)系人將根據要求進(jìn)行共享。

.  本文沒(méi)有報告原始代碼。

.  重新分析本工作文件中報告的數據所需的任何額外信息均可根據要求從領(lǐng)導聯(lián)系人處獲得。

實(shí)驗模型和研究參與者的細節

小鼠

本研究中的小鼠實(shí)驗是在圣猶大兒童研究醫院的機構動(dòng)物護理和使用委員會(huì )（IACUC）批準的方案下進(jìn)行的（方案608-100616）。圣猶大機構動(dòng)物護理和使用委員會(huì )根據《動(dòng)物護理和使用指南》批準了所有程序。小鼠按照IACUC標準飼養在微隔離籠中，以減少病原體暴露。鼠標住房設施運行在一個(gè)12-12個(gè)自動(dòng)照明系統上（12小時(shí)照明打開(kāi)，12小時(shí)照明關(guān)閉），并帶有一個(gè)獨立的通風(fēng)系統。小鼠被喂食標準食物和隨意飲水。在這些研究中進(jìn)行的分析顯示，除了將動(dòng)物體重分別按性別進(jìn)行分析和與感興趣的基因型進(jìn)行比較外，性別之間沒(méi)有差異。在我們的分析中，男性和女性的標本都是相同的。關(guān)于發(fā)育階段和基因型的完整信息可以在圖例、方法細節和關(guān)鍵資源表中找到。雌性小鼠的年齡在不同

e4細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日

6-12周用于定時(shí)妊娠進(jìn)行胚胎研究。從出生時(shí)開(kāi)始，每周給新生兒稱(chēng)重。步態(tài)分析從2周齡開(kāi)始進(jìn)行到6個(gè)月齡，并有年齡和性別匹配的隊列。

細胞系和培養條件

細胞在37歲時(shí)培養。C在5%一氧化碳2在培養基中（DMEM或DMEM F12含有4.5g/LD-葡萄糖，[-]酚紅，[-]L-谷氨酰胺，[-] HEPES，[-]丙酮酸鈉，2mML-谷氨酰胺，1mM丙酮酸鈉，1X非必需氨基酸，1%青霉素鏈霉素溶液（Gibco））。MDCK（NBL-2）、IMCD3（CRL-2123）、Shh Light II（CVCL_2721）和NIH3T3（CRL-1658）從ATCC公司中獲得。顯示器1-/-敲除（顯示器科) MEFs,22,26和迪斯普科穩定表達SHH的mef在之前已經(jīng)描述過(guò)。39Myo10重量和Myo10-/-來(lái)自男性胚胎的mef來(lái)源于以前的研究。36使用Flp-In系統（Thermo科學(xué)公司）開(kāi)發(fā)了穩定表達感興趣蛋白的克隆細胞系。pCDNA 5 FRT Disp重量或DispCS（V5/HA標記）和pOG44flp-重組酶載體被轉染，并使用潮霉素進(jìn)行篩選。穩定表達DISP的IMCD3細胞系重量或DISPCS（V5/HA標記）使用Flp-In系統生成，創(chuàng )建LacZ-FRT單克隆，然后創(chuàng )建pCDNA5FRTDISP重量或DISPCS（V5/HA標記）轉染并使用潮霉素進(jìn)行篩選。使用pLVX-Tet-On 3G系統（Takara Bio），用dox誘導的SHH病毒感染Flp-In mIMCD3s，其病毒MOI為2。在抗殺蟲(chóng)素選擇后，細胞保持在G418中以保持穩定的整合。所有細胞系均通過(guò)功能分析和免疫印跡法進(jìn)行常規驗證，并每月用真菌警報（龍沙）檢測支原體污染。根據制造商的說(shuō)明，用脂質(zhì)體3000和P3000試劑（賽默飛世爾科學(xué)公司）轉染質(zhì)粒DNA進(jìn)行瞬時(shí)蛋白表達。當需要時(shí)，通過(guò)添加對照載體DNA，使用于轉染的DNA的最終摩爾量保持不變。

方法詳細信息

Disp小鼠生成

演示1英德?tīng)?/span>（-11bp）和Disp1CS使用CRISPR-Cas9技術(shù)和直接受精卵注射建立突變小鼠模型。sgRNAs被設計為與小鼠基因組中的任何其他位點(diǎn)至少有3個(gè)堿基對（bp）的錯配，并在所需的修飾位點(diǎn)的50 bp范圍內結合。在胚胎注射前，檢測兩種化學(xué)修飾的sgRNAs（Synthego）在穩定表達Cas9的小鼠neuro2a細胞（ATCC）中的活性，并通過(guò)靶向下一代測序（NGS）進(jìn)行檢測，如前所述（DOI： 10.1038/s41598-018-19441-8）。94所得到的NGS數據使用CRIS進(jìn)行分析。py (DOI: 10.1038/s41598-019-40896-w).92裂解活性最高的sgRNA(SNP5。DISP1.g15)用于受精卵注射。將一個(gè)ssODN供體（10ng/ul，IDT）與Cas9 mRNA（10ng/ul，TriLink）和SNP5共注射。DISP1.g15（5ng/ul），用于創(chuàng )建Disp1CS小鼠模型ssODN設計為60 bp的同源臂278AAA突變，以及一個(gè)沉默的阻斷修改，以防止在一個(gè)成功的整合事件后的重新切割。演示1英德?tīng)?/span>小鼠模型是由SNP5裂解后的非同源端連接事件產(chǎn)生的雙產(chǎn)物。DISP1.g15.注射受精卵并轉移到0.5 dpc的假孕胎兒（7-10周齡的雌性與輸精管切除的雄性交配）。95編輯結構及相關(guān)引物見(jiàn)表S1。在正確修改的創(chuàng )始人動(dòng)物被確認后，小鼠被回交四代。

磁共振成像

磁共振成像（MRI）是在Bruker Clinscan 7T MRI系統（Bruker Biospin MRI有限公司，埃特林根，德國）上進(jìn)行的。掃描前，小鼠在一個(gè)腔室中麻醉（3%異氟烷氧氣1 L/min），并使用鼻錐輸送（1-2%異氟烷氧氣1 L/min）維持。為動(dòng)物提供熱支持，使用一個(gè)帶有溫水循環(huán)的加熱床和一個(gè)生理監測系統來(lái)監測呼吸率。MRI采集在小鼠頭部上方放置小鼠腦容量線(xiàn)圈，并放置在72 mm的發(fā)射/接收線(xiàn)圈內。定位器完成后，在水平（TR/TE = 3080/40 ms，矩陣大小= 256 x 256，視野= 36 mmx 36 mm，切片厚度= 0.5毫米，切片數= 20），冠狀（TR/TE=/60/42 ms，矩陣大小= 192 x 192，視野= 15毫米x15毫米，切片厚度= 0.5毫米，切片數量= 30），矢狀面（TR/TE=350/80/39 ms，矩陣尺寸= 128 x 256，視野= 16 mm x 32 mm，切片厚度= 0.5毫米，切片數= 24）定向分析3D切片機進(jìn)行MRI圖像（外科規劃實(shí)驗室）。打開(kāi)冠狀面圖像，并添加了一個(gè)新的分割方法。. 通過(guò)只繪制包含大腦的圖像區域，為整個(gè)大腦創(chuàng )建了感興趣的區域。這種情況一直持續到所有的切片上，直到整個(gè)大腦都被畫(huà)了出來(lái)。大腦的體積是通過(guò)測量根據體素尺寸計算出的繪制區域的體積來(lái)確定的。同樣，對小腦進(jìn)行了第二次分割，并以同樣的方式計算其體積。

計算機斷層掃描

計算機斷層掃描（CT）是在西門(mén)子Inveon PET/CT系統（西門(mén)子公司）上進(jìn)行的，分辨頻率為45 mm各向同性分辨率。小鼠被麻醉和支持如上所述?？倰呙钑r(shí)間為16分34秒。使用Inveon研究工作場(chǎng)所軟件（西門(mén)子）完成對CT圖像的分析。L1-L10的測量值是根據預定義的測量位置來(lái)確定的（見(jiàn)圖S1）。

細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日e5

步態(tài)分析

一條60厘米長(cháng)、5厘米寬的跑道上襯有特曼紙。小鼠（2周至6個(gè)月）在進(jìn)行實(shí)驗前被訓練穿過(guò)跑道。老鼠的爪子被涂上了兩種不同的顏色，分別作為前肢（藍色）和后肢（紅色）。. 對于每只小鼠，至少記錄3次跑步（每只動(dòng)物30-45步），并分析每只肢體的步態(tài)比（b/a）由左爪到左(a)和相應的右爪(b)之間的足跡距離（DOI：10.11111/j.1601-183X.2004.00072.x）確定。96可視化情況見(jiàn)圖1I。

神經(jīng)管成像

野生型C57BL/6J（JAX#000664）、Rosa 26 mT/mG（JAX # 007676）、Shh-Cre（JAX#005622）、Shh：：gfp（JAX#008466）、Myo10m1J（JAX#024583）和C57BL/6背景下的Disp1突變體胚胎，并進(jìn)行免疫組化處理。采用E8.5 (8-15體）或E9.5 (25-30體）期胚胎進(jìn)行分析，并比較相同體數量的胚胎。取妊娠母鼠，取子宮角，用1X PBS解剖胚胎，然后沖洗3次。整個(gè)胚胎在立體顯微鏡（徠卡）上進(jìn)行成像。胚胎在室溫下用4% PFA固定1小時(shí)，用1X PBS沖洗3次，然后移至30%蔗糖中進(jìn)行冷凍保護。第二天，胚胎被冷凍在O.C.T.中干冰上的化合物（組織-Tek）。胚胎在徠卡微米CM1950低溫恒溫器上以10 mm厚的橫向切片。切片短暫干燥，用1X TBST洗滌，然后用2% BSA、1%山羊血清、0.1% Triton-X-100在1X PBS中封閉?？贵w在封閉緩沖液中稀釋?zhuān)诩訚袷抑惺覝胤跤^(guò)夜。使用以下抗體和稀釋劑：雞抗GFP（1：500，牛，GFP-1020)、小鼠抗PAX6（1：25，DSHB，PAX6)、兔抗OLIG2（1：300，微孔，AB9610)、兔抗FOXA2（1：250，ab108422)、兔抗OLIG3（1：500，熱費舍爾，JE56-40)、兔抗pSMAD1/5/9（1：1000，CST，13820)和兔抗NKX2.2（1：200，Novus Bio、NBP1-82554)。去除一抗，切片用1XTBST洗滌3次，然后用1：500稀釋的二抗（Invitrogen）孵育3小時(shí)。切片用1XTBST洗滌3次，然后用自來(lái)水沖洗，干燥，然后用延長(cháng)金剛石安裝介質(zhì)涂抹覆蓋物。切片在徠卡DMi8廣角顯微鏡上成像，并使用LAS X進(jìn)行處理。每個(gè)基因型至少分析5個(gè)胚胎。

對于RNAscope，采集E9.5胚胎，固定，包埋，并按上述方法進(jìn)行切片。安裝后，切片按照制造商的協(xié)議（文件323100-USM）用MmGli1-C1探針，使用RNAscopem多重熒光試劑Kitv2（ACD）對mm1-C1探針（ACDBio #311001）進(jìn)行染色?？乖崛?0分鐘，蛋白酶-iii處理30分鐘。對于信號的發(fā)展，Opal-570在1：1000時(shí)使用。

對于原位雜交，收集E9.5胚胎并在4時(shí)固定4小時(shí)。C在4% PFA。原位雜交實(shí)驗如前所述（DOI： 10.3791/2912）進(jìn)行97并進(jìn)行以下修改。冷凍胚胎在15毫米厚下橫向切片，并安裝在帶電的玻片上。感覺(jué)和抗感地高辛標記的RNA探針按照制造商的說(shuō)明使用DIG RNA標記試劑盒（Roche）制作。用感覺(jué)探針作為陰性對照，未觀(guān)察到陽(yáng)性信號。每個(gè)基因型分析3個(gè)胚胎。

使用斐濟（ImiageJ）（DOI：10.1038/nmeth019）對神經(jīng)管切片進(jìn)行定量分析。.288所有的分析均在心臟水平的橫切面上進(jìn)行，通過(guò)鰓囊、主動(dòng)脈囊的位置和心房/心室的大小/形態(tài)來(lái)確定。小鼠發(fā)育板19b的考夫曼圖譜圖像g-h顯示了我們所示的心臟水平圖像圖2的區域，并進(jìn)行了表達域定量分析。98通過(guò)測量神經(jīng)元祖細胞標記物（PAX6、OLIG2、NKX2.2、FOXA2）相對于整個(gè)神經(jīng)管區域的表達域面積，分析位于體2附近的橫向心臟水平切片。每個(gè)基因型分析3~5個(gè)胚胎，每個(gè)胚胎分析5~8個(gè)切片。通過(guò)測量所示表達域的面積，并將其歸一化為每個(gè)切片中所分析的神經(jīng)管的總面積，來(lái)計算表達域面積。

表達域強度線(xiàn)繪圖數據如之前報道的那樣生成(DOI： 10.1371/journal。pbio.1002119).99簡(jiǎn)單地說(shuō)，通過(guò)神經(jīng)管兩側的神經(jīng)上皮細胞的中心團塊，追蹤出一條20像素寬的線(xiàn)。從底板中線(xiàn)的底面到頂板中線(xiàn)的基面。每個(gè)基因型有3個(gè)胚胎，每個(gè)胚胎共分析4-8個(gè)切片。除Gli1原位雜交圖未轉化且基于檢測到的熒光外，單個(gè)線(xiàn)圖歸一化，最小值設置為0，最大值設置為100。數據用所有線(xiàn)± SEM的平均強度表示。與線(xiàn)形圖數據一樣，測量祖細胞標記物的相對和絕對背側/腹側位置，其值基于從底板中線(xiàn)通過(guò)神經(jīng)上皮細胞中心質(zhì)量到頂板中線(xiàn)的距離。相對位置值被確定為每個(gè)分析切片的總FP與RP軌跡長(cháng)度的比值。記錄每個(gè)標記物的表達域、背側起始位置和腹側端點(diǎn)，并進(jìn)行不同基因型間的比較。從FP中線(xiàn)到RP的直線(xiàn)測量垂直D/V長(cháng)度。每個(gè)基因型有3個(gè)胚胎，每個(gè)胚胎有5~8個(gè)切片。

小鼠胚胎中細胞素的保存和成像

準備對胚胎進(jìn)行細胞素分析（DOI： 10.3791/64100）。57胚胎被解剖成不完全生長(cháng)的培養基，然后用漢克斯平衡鹽溶液（HBSS）沖洗。胚胎在HBSS+4%多聚甲醛中輕輕搖晃固定45分鐘。固定后，用含Ca的PBS洗滌胚胎3次2+和鎂2+和0.1%的Triton，每次洗30分鐘。胚胎在塊狀(含Ca2+和鎂2+，0.1%的Triton，和5%的山羊

e6細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日

血清)與溫和的攪拌。然后胚胎在一抗溶液中孵育(抗體用PBS稀釋2+和鎂2+，0.1% Tween-20和5%山羊血清)472小時(shí)。C與溫和的搖擺。使用以下抗體：雞抗GFP（1：250，Aves、GFP-1020)、小鼠抗SHH（1：100、DSHB、5E1上清）、兔抗Olig2（1：300、微孔、AB9610)和兔抗ARL13B（1：500，蛋白蛋白，17711-1-AP)。初次孵育后，胚胎在溫和攪拌下連續洗滌5次，持續1小時(shí)。胚胎在F(ab’）中孵育2片段二抗溶液（1：1000抗體稀釋?zhuān)?2小時(shí)，輕輕旋轉4小時(shí)。C在黑暗中。如果不需要肌動(dòng)蛋白染色，胚胎與DAPI孵育1小時(shí)，然后用方塊洗滌3次，每次10分鐘。最后一系列用PBS洗滌三次20分鐘2+和鎂2+，取0.1% Tween-20，包埋前將胚胎保存在溶液中。

胚胎用4%的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶解在HBSS或PBS中2+和鎂2+.包埋的胚胎用100或150毫米的振動(dòng)計進(jìn)行切片。f-肌動(dòng)蛋白染色，切片用放線(xiàn)菌（熱fisher）和DAPI孵育40分鐘，然后切片用塊洗滌一次，然后用Ca在PBS中洗滌兩次. 2+和鎂2+，0.1% Tween-20，每次洗20分鐘。切片用延長(cháng)金剛石法安裝在載玻片上。組織切片用TCS SP8 STED 3X共聚焦顯微鏡（徠卡）成像，然后在光子計數模式下進(jìn)行閃電反褶積計數或衛星tauSTED（徠卡）成像。每個(gè)基因型至少有3個(gè)胚胎被分析，所有基因型之間的比較進(jìn)行相同數量的體匹配胚胎。為了減輕來(lái)自低水平非特異性GFP信號的干擾，所有SHH的體內定量均使用抗SHH信號進(jìn)行計算。

細胞培養中細胞素的保存與分析

細胞固定和染色采用mem固定方案(DOI： 10.21769/BioProtoc。2898).100轉染后再復制到蓋玻片上，細胞用4%甲醛、0.5%戊二醛和0固定。1M磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）溶液，持續7分鐘。從這一點(diǎn)開(kāi)始，所有的溶液都被輕輕地移液，以減少在清洗期間對盤(pán)子的攪拌。固定后，用PBS洗滌細胞3次，每次洗滌5分鐘。細胞在由5%正常山羊血清和0.1% Triton X-100組成的緩沖液中滲透，1 mg/mlNaBH4溶液在蒸餾水中溶解45分鐘。有關(guān)抗體孵育的詳細信息，請參閱“免疫熒光和成像染色方案”部分。

我們將用于定量的細胞素定義為直徑約為<200 nm、最小長(cháng)度為10 mm的細胞投射物(DOI： 10.7554/eLife。61432).36任何沿著(zhù)其整個(gè)長(cháng)度與覆蓋物保持持續接觸的細胞突起都被排除在分析之外。100細胞素發(fā)生率計數在3個(gè)覆蓋物中至少100個(gè)細胞，至少2個(gè)生物重復。細胞素與細胞體的平均熒光強度比是通過(guò)測量單個(gè)細胞素的平均熒光強度超過(guò)其原始細胞體的平均熒光強度來(lái)計算的，每個(gè)條件下共分析n=44-80個(gè)細胞素。通過(guò)測定2個(gè)生物重復中n=44或46個(gè)細胞素內每個(gè)蛋白的相對熒光強度比，分析DISP變異與SHH-GFP的線(xiàn)性回歸分析。

使用Ca測量基于細胞素的SHH信號激活2+SHH接收細胞的通量速率如下所述。36. 簡(jiǎn)單地說(shuō)，將2 mg質(zhì)粒DNA轉染到6孔板pCMV-R-GECO1的單個(gè)孔細胞中，用于NIH3T3“接收”傳感器細胞，將pCDNA3-mSHH-FL-EGFP用于DISP變體MEF“產(chǎn)生”細胞。轉染24小時(shí)后，細胞被胰蛋白酶化，并復制到8個(gè)孔，聚苯乙烯室，放置在1.5硼硅酸鹽蓋玻璃上，0.7厘米2/嗯（Nunc實(shí)驗室-TekII）。將細胞接種到以…40%的細胞密度（20% R-GECO，20% SHH-GFP）培養出來(lái)的腔室孔中，并在成像前恢復至少4小時(shí)。在PBS中輕輕清洗細胞，在成像前用新鮮培養基替換培養基以去除分泌的SHH，以確保信號來(lái)自細胞素傳遞的配體。在37歲時(shí)進(jìn)行了實(shí)時(shí)成像。C, 5% CO2. 在整個(gè)細胞素深度（…4-6mm）上，每個(gè)區域進(jìn)行15 min的共振掃描，z步長(cháng)為…0.6-1.0mm生成最大強度投影，用于后續的時(shí)間間隔分析。對每個(gè)細胞的R-GECO熒光強度直方圖進(jìn)行歸一化處理，最小熒光為0，最大熒光為100。加拿大2+通量的發(fā)生被量化為R-GECO熒光的相對峰值，最小熒光峰值為50。只有與來(lái)自SHH-GFP產(chǎn)生細胞的細胞素接觸的R-GECO細胞被定量進(jìn)行分析，任何在掃描期間沒(méi)有顯示出單一通量的R-GECO細胞都被排除在分析之外。從3個(gè)生物重復中，每個(gè)條件下共分析了n個(gè)=31-41個(gè)細胞。

脊索和神經(jīng)管腔內沿細胞素的SHH斑點(diǎn)分析

我們開(kāi)發(fā)了一個(gè)工作流程管道來(lái)量化從脊索到周?chē)毎徒M織的數量。未處理的抗SHH通道從。使用斐濟（圖像J）從掃描系列中提取以0.33mmz步間隔拍攝的50-90張圖像. 88并進(jìn)行快速傅里葉變換（FFT）帶通濾波。其余的通道染色（DAPI，F-actin，anti-GFP）被合并并總結作為一個(gè)細胞輪廓掩膜。然后通過(guò)Ilastik（DOI： 10.1038/s41592-019-0582-9）運行單元格輪廓掩碼系列90訓練生成一個(gè)定義細胞體和細胞素的分割掩模系列。然后將分割掩模和過(guò)濾后的SHH系列在斐濟進(jìn)行重組88與圖像計算器的功能。通過(guò)閾值法（閾值法采用最大熵分析，范圍為10-100）確定SHH斑點(diǎn)，然后將粒子分析設置為10-60像素，以排除過(guò)小或過(guò)大的斑點(diǎn)。每個(gè)基因型分析了9到15個(gè)組織切片，代表440-797張圖像。

通過(guò)閾值化和計數前10 mm內的管腔SHH斑點(diǎn)，對E8.5胚胎的管腔SHH斑點(diǎn)進(jìn)行定量

（…30個(gè)z步）的組織切片與斐濟。88在連續的z步中，相同位置的斑點(diǎn)只計算一次。共計

細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日e7

. 分析每個(gè)基因型6-8個(gè)胚胎的18-20個(gè)切片，以量化SHH神經(jīng)管腔（NTL）信號強度，沿NTL繪制一個(gè)感興趣區域（ROI），并在NT細胞體內繪制第二個(gè)ROI作為背景校正。每個(gè)切片的平均信號強度由平均NTL信號減去平均NT信號來(lái)確定。所有的體內定量均采用抗SHH信號進(jìn)行。

測序

顯示器1CS/+雌性與Disp1雜交印第安納州/+雄性產(chǎn)生E9.5對照（野生型）和Disp1CS/INDEL晶胚同樣，Myo10m1J/+雌性與Myo10雜交m1J/+雄性產(chǎn)生E8.5對照(Myo10+/+)和Myo10m1J/m1J晶胚收集多個(gè)窩，每個(gè)基因型使用5對體匹配的窩崽（5個(gè)對照，5個(gè)突變體），以最大限度地提高遺傳變異。采集妊娠母鼠，解剖胚胎，每個(gè)胚胎置于1.5 mL的埃彭多夫管中，在液氮中快速冷凍，然后在-80℃保存，進(jìn)行基因分型。一旦產(chǎn)生5對胚胎，所有樣本同時(shí)純化。每個(gè)整個(gè)胚胎均質(zhì)，使用RNeasy Micro Kit（Qiagen）使用制造商的協(xié)議提取RNA。每個(gè)樣本根據manufacturer‘sinstructions，使用RruSeqRNA樣本Prep v2試劑盒（Illumina）制備1 mg的RNA測序文庫，并在Illumina NovaSeq 6000上完成測序。使用CLC基因組學(xué)工作臺v20.0.4（10agen）篩選質(zhì)量（類(lèi)似Q20或更長(cháng)），并與小鼠參考序列GRCm39（UCSC mm39）對齊。TPM（每百萬(wàn)轉錄本）計數由CLC RNA-Seq分析工具生成。差異基因表達分析采用非參數方差分析，使用Kruskal-Wallis和Dunn對兩個(gè)實(shí)驗組的對數轉換的檢驗，在Partek基因組套件v7.0軟件（Partek Inc.）中實(shí)現。使用GSEA (DOI： 10.1073/pnas。0506580102).93數據集已存儲在基因表達綜合系統上，并可在登錄號（GSE242161）下公開(kāi)獲得。

細胞培養用的免疫熒光和圖像采集

細胞在覆蓋物上生長(cháng)，然后用PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定，然后用0.1%Triton+PBS沖洗3次5分鐘，用塊孵育(PBS，0。兔抗SHH（1：100、160）、1：800、46449）、兔抗V5（1：300、1：200、CST、Pk1）、兔抗Rab11（1：1：800、1：200、1：200、CA2）、CST、51：1）、1：100）、兔抗網(wǎng)格蛋白重鏈（1：1：100、CST、4796)。. . 第二天，用塊洗滌3次，10分鐘，使用二抗（杰克遜免疫研究和邀請試劑），1：1000稀釋?zhuān)尤隓API和肌動(dòng)蛋白紅（邀請試劑）孵育1小時(shí)。使用延長(cháng)玻璃抗褪色支架（Invitrogen）清洗和安裝蓋板。顯微鏡圖像用TCS SP8 STED 3X共聚焦顯微鏡（Leica）或A1R共聚焦（尼康）拍攝，用于固定和活細胞成像。

圖像處理與分析

圖像采集后，使用LAS X（Leica）、ImageJ、88和Photoshop 2022（Adobe），并使用插畫(huà)家2022（Adobe）制作數字。在TCS SP8 STED 3X共聚焦顯微鏡上獲得的神經(jīng)管細胞質(zhì)鏡成像，使用閃電軟件（徠卡）進(jìn)行反褶積。用ImageJ處理視頻，88LAS X，Amira（ThermoFisher）和首映式Pro（Adobe）。EM圖像數據使用Amira（熱莫費舍爾）、Ilastik、90以及用于大量圖像數據的協(xié)作注釋工具包（貓女）（DOI：10.1093/bioinformatics/btp266）。72,91除非另有說(shuō)明，圖像以跨越單元或感興趣區域的z-堆棧采集的最大強度投影（MIP）表示。除非另有說(shuō)明，所顯示的圖像代表了在多個(gè)實(shí)驗中至少三個(gè)生物復制的標準細胞或組織切片。

質(zhì)粒

在本研究中使用了以下質(zhì)粒：

pCDNA（控制載體）（克隆技術(shù)V79020），pCMV3-hBMP2-GFPSpark（中國生物HG10426-ACG），pCMV3-hBMP4-OBMP4-OFPSpark（中國生物HG10609-ACR），pCMV3-hBMP7-GFP-GFPSpark（中國生物HG10083-ACG），pCMV3-hWNT1-GFPSpark（中國生物HG10721-ACG），pCDNA3-EGFP（添加基因質(zhì)粒#13031），pCMV-m櫻桃膜86（Addgene質(zhì)粒#55779），pCMV-R-GECO187（Addgene質(zhì)粒#32444），pCMV-mCherry2（Addgene質(zhì)粒#54517），pCDNA3.1-mSHH-FL，39pCDNA3.1mSHH-FL-EGFP,36pCDNA3.1-mSHH-FL-mCherry2,36pCDNA3.1-V5-DISP重量-HA39（加增基因質(zhì)粒#126410），pCDNA3.1-V5DISPCS-HA,39pCDNA3.1-V5-DISPΔC-HA, pCDNA3.1-V5-DISP4xAA-HA, pCDNA3.1-V5-DISP重量-Dronpa3-HA, pCDNA3.1-V5-DISPCS- Dronpa3-HA, pCDNA3.1-DISPΔC-Dronpa3-HA.Dronpa3構建物來(lái)自Dronpa3-N1（Addgene質(zhì)粒#54682），并插入到DISP殘基A695和V696之間。Dronpa3PCR（NEB）酶切位點(diǎn)擴增后，用Phusion PCR（NEB）擴增到IC3。AP2/網(wǎng)格蛋白結合突變體DISPΔC和DISP4xAA使用Quik改變誘變技術(shù)（Quik Change II XL定點(diǎn)誘變試劑盒，安捷倫，200522）創(chuàng )建。

Dronpa3 BsrG1引物：

Forward:5' tatagatccACCGGTCtgtacaATGGTGAGTGTGATT 3'

e8細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日

反向： 5‘ tataAGTCGCGGCCGCCTAtgtacaCTTGGCCTGCCT 3”

快速更換引物：

c端刪除5‘gagccaggctcagccCTCGAGtacccctac 3’

DISP1 L1249/1250A引物：

前進(jìn)： 5‘ ccaggctcagccgcggcgcagtcctgtctg 3”

反向： 5‘ cagacaggactgcgccgcggctgagcctgg 3”

DISP1 L1324/1325A引物：

前進(jìn)： 5‘ caagccgccgagggcgctgcgcaccctgcccag 3”

反向： 5‘ ctgggcagggtgcgcagcgccctcggcggcttg 3”

DISP1 L1441/1442A引物：

前進(jìn)： 5‘ gtggagccaagcgcggcgcagaccgatgaa 3”

反向： 5‘ ttcatcggtctgcgccgcgcttggctccac 3”

DISP1 L1516/1517A引物：

前進(jìn)： 5‘ actcagacctgtctggcgagagtgcggcaataaaaacactactcgagtacc 3”

反向： 5‘ ggtactcgagtagtgtttttattgccgcactctcgccagacaggtctgagt 3”

蛋白質(zhì)穩定性環(huán)己酰亞胺測定法

分配科Flp-Inmef穩定表達V5-DISP重量-HA或V5-DISPCS-HA瞬時(shí)轉染pCDNA3.1-mSHH-FL或空載體對照。轉染后，將細胞復制到60 mm內2組織培養皿，培養過(guò)夜。. 將環(huán)己酰亞胺（20mg/mL，溶解在DMSO中）加入到所有平板中，用0、2、4、6、8、1倍RIPA緩沖液裂解12小時(shí)（Thermo科學(xué)）。. 細胞裂解物的蛋白質(zhì)含量歸一化，用westernblot檢測DISP（大鼠抗ha，1：2000，Roche，11867423001）和裝載對照小鼠抗微管蛋白（1：1微管蛋白10000，CST，DM1A）。使用密度測定法（ImageJ）計算剩余蛋白的比例88的時(shí)間點(diǎn)除以0個(gè)時(shí)間點(diǎn)的密度測量法。

免疫印跡法和免疫共沉淀法

為了進(jìn)行蛋白印跡，SDS-PAGE樣品在4-15%三甘氨酸SDS-PAGE凝膠（Bio-Rad）上運行，并使用Tris/甘氨酸/SDS緩沖液（Bio-Rad）轉移到固定p PVDF（微孔）上，1小時(shí)。在室溫下，用5%的牛奶和0.1% Tween-20（TBST）或5% BSA inTBST的tris緩沖鹽水封閉膜1小時(shí)。抗體稀釋度為抗HA（1：3000；羅氏3F10)、抗V5（1：2000；生命技術(shù)SV5-Pk1)、抗SHH（1：2000；CST C9C5)、兔抗驅動(dòng)蛋白（抗Kif5B，1：5000；Abcam ab167429)和/或微管蛋白（1：10000；CST DM1A)，阿爾法適應蛋白（1：1000，熱科學(xué)AC1-M11）（1：1000，貝氏生物科學(xué)A304-718A）。相應的HRP偶聯(lián)二抗（Jackson免疫）孵育1 hrat RT ata 1：5000濃度。紅外抗體（Li-Cor）在雙聯(lián)時(shí)使用HRP偶聯(lián)抗體的1：10000濃度。印跡是通過(guò)使用奧德賽Fc（Li-Cor）和ECL Prime（GE）開(kāi)發(fā)的。

如Marada等人所述，進(jìn)行了生物素化分析和隨后的密度測定法。(DOI: 10.1371/journal.pgen.1005473).101簡(jiǎn)單地說(shuō)，活細胞用冷PBS（pH 7.4）洗滌3次，然后在4時(shí)輕輕搖晃30分鐘。C在含有0.5 mg/ml EZ-LinkSulfo-nhs-生物素的PBS中（熱科學(xué)）。生物素化通過(guò)用含有50 mMTris的冷PBS洗滌兩次細胞來(lái)猝滅。收集細胞并用RIPA緩沖液裂解。裂解液與50 ml鏈霉親和素瓊脂糖珠（熱科學(xué)）一起孵育1小時(shí)。C. 然后用RIPA緩沖液洗滌珠子三次，在含有2 mM游離生物素的煮沸樣品緩沖液中提取珠子結合蛋白。用SDS-PAGE和western blot分析上清液和鏈霉親和素珠洗脫后的蛋白。使用斐濟進(jìn)行密度分析，并測定鏈霉親和素結合的細胞表面與裂解液DISP的信號密度比值。

為了進(jìn)行免疫沉淀，將穩定表達全長(cháng)SHH的小鼠胚胎成纖維細胞瞬時(shí)轉染，表達野生型、CS突變體或ΔC DISP蛋白。然后培養細胞，在修飾的HK緩沖液（20mM HEPES，10 mM氯化鉀；pH 7.9）+ 2.5%甘油+50mM氯化鈉)中分離質(zhì)膜組分。102蛋白質(zhì)含量歸一化，膜組分用蛋白A/G Plus瓊脂糖（Santa Cruz SC-2003）預清除，樣品用EZview Red抗HA親和凝膠（E6779-1ML，微孔Sigma）在4C下免疫沉淀1.5小時(shí)。然后在室溫下在裂解緩沖液和150 mM氯化鈉中洗滌3 x 5 min，并在室溫下在5X SDS緩沖液中洗脫。采用SDS-PAGE和免疫印跡分析AP2和HA(A（1：101011）、β（1：1000，貝氏生物科學(xué)A304-718A）、HA (1：3000，羅氏，3F10）。

球體生成與分析

使用穩定表達野生型或CS突變型V5-DISP-HA蛋白和強力霉素誘導的SHH的IMCD3細胞生成球狀體（DOI： 10.1038/nprot181）。.2014.51球體固定前24小時(shí)，用100ng/mL的強力霉素培養基誘導SHH表達。第二天，球狀體被固定和染色。51對球狀體進(jìn)行兔抗shh（1：100，Santa Cruz，H-160)、大鼠抗ha（1：250，Roche，3F10）、小鼠抗v5（1：300，生命技術(shù)，SV5-Pk1）染色。二抗染色時(shí)進(jìn)行F-actin和DAPI染色（1：1000）。染色后，IMCD3球狀體安裝在熒光計-g（ThermoFisher）中，并在尼康A1R掃描共聚焦顯微鏡上成像。

細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日e9

以0.4 μm的間隔對整個(gè)球狀體進(jìn)行掃描。只有包含明確管腔的球狀體和單層細胞被用于分析。對細胞中心的單個(gè)細胞進(jìn)行分析（DAPI占細胞最大體積）。單個(gè)細胞的頂端和基底表面由最大的f-肌動(dòng)蛋白熒光來(lái)定義。HA的DISP定位分布曲線(xiàn)計算為沿基底至頂端細胞膜的強度線(xiàn)曲線(xiàn)。數據歸一化為1，每個(gè)條件下分析n= 21-29個(gè)細胞，取自多個(gè)實(shí)驗的3個(gè)生物重復。對于頂端超過(guò)基礎熒光強度比，測量細胞的頂端和基礎表面的平均強度值（由峰值f-肌動(dòng)蛋白強度定義），并對每個(gè)細胞進(jìn)行比較。值<1表示主要是基礎蛋白積累，>1表示根尖積累（腔面），每個(gè)條件下有n= 40-47個(gè)細胞。

共定位分析

在單個(gè)細胞的內吞體區域內分析DISP-HA和單個(gè)內吞體標記物之間的共定位。Pearson的相關(guān)系數值代表了所分析的內吞體腔室內的DISP的部分，并不代表整個(gè)細胞體積。為了進(jìn)行分析，掃描的細胞體積作為最大強度投影（MIPs）。伊拉斯蒂克90用于內體染色的輸出MIPs，生成突出內體標記物的分割掩膜。然后，mip和掩碼通過(guò)細胞分析器中的一個(gè)輔助管道運行(DOI： 10.1371/journal。pbio.2005970)89在測量皮爾遜相關(guān)系數的同時(shí)測量皮爾遜相關(guān)系數。輸入圖像包括1)f-肌動(dòng)蛋白或SHH-mCherry（瞬時(shí)轉染mef）輪廓和分段單個(gè)細胞在掃描區域，2) DAPI作為參考節點(diǎn)f-肌動(dòng)蛋白分割和數量細胞每個(gè)掃描區域，3) HA測量DISP，4)內吞體標記測量感興趣的內吞體標記，和5)分割面具細化共定位內吞體分析區域標記。對標記物進(jìn)行分類(lèi)并輸入管道，根據HA和內體標記物的適當閾值，計算內體室內每個(gè)細胞的相關(guān)系數。輸出數據中低于曾15百分位的任何f-肌動(dòng)蛋白標記的細胞區域被排除在數據集中，以避免死亡或細胞部分。在這些實(shí)驗中，=60-126對照轉染細胞和=23-39轉染的SHH細胞從3個(gè)生物重復中進(jìn)行了分析。

DISP膜內化

MDCK cellsexpressing DISP重量-Dronpa3, DISPCS-Dronpa3或DISPΔC-Dronpa3被鍍在Lab-Tek II室載玻片上，并允許其生長(cháng)，直到它們形成單層。抽吸細胞培養基，用含有10 mM HEPES的無(wú)血清培養基替換。細胞用aTCSSP8 STED 3x共聚焦顯微鏡（徠卡）成像，配備enclosureboxheatedto37C，5%CO2for80minutesat2.5-minuteincrementswithz-seriescoveringtheentirecellvolumeofthemonolayer.對DISP-Dronpa3構建物進(jìn)行成像30分鐘，以監測任何光漂白或光毒性的影響（未檢測到）。在培養基中加入25 μM Pitstop 2（ab120687，abcam，溶解在DMSO中），阻斷內吞作用，導致DISP-Dronpa3在細胞表面上積累30分鐘。隨后，將含有10%胎牛血清的培養基替換Pitstop2治療的無(wú)血清培養基，然后每2.5分鐘繼續成像50分鐘，以測量恢復情況。

在這個(gè)時(shí)間過(guò)程中，通過(guò)ROI沿著(zhù)相鄰細胞膜的細胞-細胞界面進(jìn)行標記來(lái)測量DISP-Dronpa3構建物的膜積累和隨后的內化率。使用LAS X軟件記錄Dronpa3沿膜的熒光強度。在添加Pitstop 2為1后，將每個(gè)ROI的數據歸一化，時(shí)間點(diǎn)0的熒光強度歸一化。在Pitstop 2洗脫后，時(shí)間點(diǎn)0的熒光強度也被歸一化為1。每個(gè)條件下從3個(gè)生物重復中分析n=31-57個(gè)細胞roi。

熒光素酶報告分析

分配科穩定表達MSCV-Hygro或MSCV Hygro-Shh的mef以5 3 10的密度播種56孔板中的每孔細胞。第二天，將pcDNA3-V5-WT Disp-HA（3 μg）或pcDNA3-V5-CS Disp-HA（3 μg）轉染到Disp中科表達載體或Shh的細胞。同時(shí)，聚苯乙烯克隆缸（內徑9.5mm的x 6.2 mm高度，科學(xué)軟件，Bel-Art）在70%乙醇消毒，在無(wú)菌PBS洗滌，干燥，放置在12孔的中心孔板，創(chuàng )建一個(gè)障礙的內環(huán)和外環(huán)之間的井，如前所述。39Shh Light II報告細胞103,104是在1 3 10點(diǎn)播種的嗎5圓柱體外環(huán)周?chē)募毎?/span>分配科轉染了Disp表達載體的穩定細胞以5 3 10的密度接種4圓柱體內環(huán)內每口孔的單元。細胞在允許之間恢復。第二天，從細胞中移除培養基，并移除圓柱體，在Shh Light II和Disp之間形成一個(gè)無(wú)細胞的屏障科細胞細胞用PBS洗滌3次，然后用DMEM無(wú)血清完全培養基洗滌。每孔中均加入DMEM無(wú)血清完全培養基，孵育2小時(shí)。每2小時(shí)更換一次，共6小時(shí)。6小時(shí)后，每孔加入1 mL DMEM無(wú)血清完全培養基，讓細胞孵育曾36小時(shí)。報告基因檢測根據雙熒光素酶報告試劑盒說(shuō)明（Promega）進(jìn)行。實(shí)驗重復三次，重復三次，所有數據合并。

掃描電鏡和定量

E9.5胚胎（n=8）固定在2.5%戊二醛、2%多聚甲醛和含2 mM MgCl的0.1 M碳酸鈣緩沖液中2.固定后，將樣本斬首，然后將一根針插入前神經(jīng)管，將胚胎平分

e10細胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日

矢狀面暴露神經(jīng)管腔、底板和脊索的內部。解剖樣品用緩沖液洗滌，0.1%四氧化鋨水溶液固定1小時(shí)，用ddH洗滌2O，用上升的乙醇系列脫水，臨界點(diǎn)在液體CO中干燥2使用自動(dòng)采樣931（圖動(dòng)）。干燥的樣品在15 nm銥的行星旋轉下濺射涂層，并使用埃弗哈特-索恩利和T1探測器在2 kV的熱費舍爾科學(xué)透鏡掃描電子顯微鏡下成像。用Ilastik分離延伸和初級纖毛，對神經(jīng)管腔細胞延伸到初級纖毛接觸進(jìn)行顯微鏡分析90生成分割掩碼。利用二次手動(dòng)分割來(lái)驗證纖毛。然后將分割掩模輸入到ImageJ中88通過(guò)曼德斯系數分析來(lái)分配對象計數和測量覆蓋（接觸），每個(gè)基因型分析了4到10張顯微照片，共計1784條初級纖毛和39070張延伸(n=344 Disp1. +/+, n=684 Disp1印第安納州/+和n=756 Disp1英德?tīng)?/span>初級纖毛)。擴展計數包含的閾值被調整為包含在每個(gè)顯微照片中大于纖毛的任何物體。我們通過(guò)人工計數一個(gè)胚胎上的纖毛接觸（從5張顯微照片中總共有389個(gè)初級纖毛），驗證了我們的自動(dòng)管道的準確性。胚胎自動(dòng)分析確定53.89%的初級纖毛與細胞延伸接觸，SD為15.44，而人工分析確定52.18%與SD接觸為10.16接觸，表明我們的管道是準確的。

連續塊面掃描電鏡

E9.5 Disp1+/+, Disp1CS/+, Disp1印第安納州/+, Disp1CS/INDEL, Disp1英德?tīng)?/span>, Myo10+/m1J和Myo10m1J/m1J胚胎被固定在2.5%胚胎中戊二醛，2%多聚甲醛在0.1M碳酸氫酸鹽緩沖液中。固定后，樣品在室溫下在2%四氧化鋨碘化緩沖液中固定90分鐘，然后直接轉移到碳酸氫鹽緩沖液中的2.5%亞鐵氰化鉀中。樣品用ddH2O徹底沖洗，40時(shí)孵育。C在1%硫脲酰肼中浸泡45分鐘，然后再次徹底清洗，然后在2%四氧化鋨水溶液中室溫孵育90分鐘。樣品用ddH2O沖洗，并在1%的醋酸鈾酰水溶液中孵育過(guò)夜。然后C被加熱到50。C30分鐘，在室溫下保持1小時(shí)，恢復到50。. 用ddH2O徹底沖洗后，樣品在一系列上升的乙醇中脫水，在環(huán)氧丙烷中過(guò)渡，并用EMBed-812環(huán)氧樹(shù)脂滲透。100% EMBed-812中的樣品在60處聚合。C2天。選定的樣品被裁剪、安裝、涂上銥，并安裝在賽默費舍爾科學(xué)型體積鏡掃描電鏡中進(jìn)行成像。成像條件，包括為了緩解電荷的水蒸氣壓力，根據每個(gè)樣品進(jìn)行調整，以確保一致的成像和切割。每個(gè)基因型至少有2個(gè)胚胎，每個(gè)胚胎進(jìn)行2個(gè)個(gè)體掃描系列。單個(gè)掃描系列由大約500-1000個(gè)連續切片組成，組織深度為50-100mm，X，Y分辨率為20-40x20-40nm/像素，連續切片為60-100nm間隔。用Amira（ThermoFisher）生成片段對齊和體積渲染的單個(gè)細胞。數據集被上傳到貓女那里72,91用于量化細胞延伸的長(cháng)度和頻率。膜延伸被分割，并通過(guò)整個(gè)掃描區域的連續切片進(jìn)行單獨映射，直到它們的終點(diǎn)或細胞-細胞膜密度超過(guò)分辨率，阻止了進(jìn)一步的延伸映射。從10個(gè)連續切片（…1mm深度）的延伸/核值進(jìn)行定量，以確認膜泡是連續延伸的，每個(gè)胚胎分析1mm厚的切片系列。. 5-10

量化與統計分析

每個(gè)實(shí)驗中使用的小鼠的數量和發(fā)育階段在圖形或圖形圖例中給出。在分析中使用的額外數字(n)包括在方法細節中用于個(gè)別實(shí)驗。實(shí)驗沒(méi)有以盲法進(jìn)行，除了分析……MYO10實(shí)驗中的E8.5胚胎，如圖7所示。所有統計分析均采用GraphPad Prism進(jìn)行。多重比較采用單因素方差分析，以Tukey的多重比較作為后檢驗。兩種條件之間的顯著(zhù)差異由雙尾學(xué)生st檢驗確定。共定位定量采用細胞分析儀進(jìn)行89或ImageJ（斐濟）88在適當的情況下，用皮爾遜相關(guān)系數或曼德的記分系數進(jìn)行分析。除非另有說(shuō)明，所有量化數據均以平均± SD表示，p<0.05被認為具有統計學(xué)意義。顯著(zhù)性描述為**<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0。. 0001，ns =不顯著(zhù)。

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圖S1。CRISPR-cas9生成的Disp1突變小鼠表現出表型，與圖1相關(guān)

利用(A) CRISPR-Cas9基因靶向技術(shù)，生成了一個(gè)在DISP第一個(gè)細胞外環(huán)中保守的Furin切割位點(diǎn)發(fā)生突變的敲除小鼠。基因靶向導致產(chǎn)生所需的等位基因(278RRE到AAA，Disp1CS)和一個(gè)11個(gè)堿基對的缺失突變體(Disp1英德?tīng)?/span>).DISP蛋白的示意圖顯示了Furin裂解位點(diǎn)以及用于生化和細胞生物學(xué)分析的V5和HA表位標簽。該基因敲除的小鼠沒(méi)有V5或HA表位標簽。指出了DISP甾醇傳感域（SSD）和轉運體基序。

（帶C) P35 Disp1CS/CS小鼠表現出可變的腦積水(B0)，但與同窩對照動(dòng)物相比，體型沒(méi)有明顯減少。（下頁(yè)繼續圖例）

(D) P0 Disp1CS/INDEL幼崽比同窩的對照組小鼠要小。

(E)與圖1D對應的冠狀面MRI0顯示為Disp1CS/+和顯示器1CS/INDEL老鼠

(F)microct生成的男性頭骨的3D渲染CS/+和顯示器1CS/INDEL老鼠顯示。

(G) MicroCT線(xiàn)性測量標志，用于分析顱骨沿矢狀面和水平面的MicroCT線(xiàn)性測量標志顯示。

(G0)從12個(gè)Disp1中計算出的指示地標（L1-L10）的線(xiàn)性測量結果CS/+和10 Disp1CS/INDEL老鼠合并男性和女性的數據，結果顯示為平均± SD。

S2。E9.5對照和Disp1的基因表達分析CS/INDEL突變體胚胎，與圖2相關(guān)

(A)箱形圖顯示了所示基因型的E9.5/27-29體細胞胚胎的祖細胞結構域的絕對邊界。從FP開(kāi)始的腹側的位置顯示在每個(gè)盒子的底部，而背側的位置顯示在每個(gè)盒子的頂部。

(A0)顯示了相應的指示基因型E9.5胚胎神經(jīng)管的平均垂直DV長(cháng)度。n = 3個(gè)胚胎，每個(gè)胚胎測量5-8個(gè)切片。數據以平均±SD顯著(zhù)性表示，表示為*p < 0.05，****p < 0.0001，ns =不顯著(zhù)。.

（C帶）Gli1原位雜交的心臟水平切片的E9.5/27-29體細胞胚胎的指示基因型顯示。顯示器1CS/INDEL與對照組相比，神經(jīng)管對Gli1的誘導作用減少，表明SHH靶基因的激活減少。

(D)這是一個(gè)原木的火山圖10的p值。Disp1中mRNA表達的對數比倍變化CS/INDEL胚胎與Disp1比較+/+胚胎（每個(gè)基因型為n=4）。p值<為0.01和log的基因2比值>為0.5（右上象限）和<為0.5（左上象限）。

（下頁(yè)繼續圖例）

(E)京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）差異表達基因的通路分析。在Disp1中富集的基因集的歸一化富集分數CS/INDEL胚胎與Disp1比較+/+通過(guò)基因集合富集分析（GSEA）來(lái)確定。黑色為正富集通路，灰色為負富集通路。

(F)根據對數尺度上的頂級差異調控基因的熱圖進(jìn)行排序（每個(gè)基因型n=4）。

(G)在Disp1中富含差異調控基因的Wiki通路CS/INDEL胚胎與Disp1比較+/+對照與p < 0.05（352個(gè)基因）使用richR。

圖S3。DISP細胞表面定位和穩定性分析，見(jiàn)圖3和圖4

(A)細胞裂解物和(A0)共聚焦顯微鏡觀(guān)察穩定表達WT或CS V5-DISP-HA蛋白的IMCD3細胞的球狀體顯示多西土霉素誘導的SHH。(A)橙色箭頭標記已切割的DISP，藍色箭頭標記切割的DISP。a-微管蛋白是加載控制蛋白。(A0) DAPI為藍色，SHH為黃色。

(B)細胞表面生物素化進(jìn)行細胞表面生物素化科穩定表達WT和CS V5-DISP-HA蛋白。在鏈霉親和素珠上收集生物素化蛋白，用蛋白印跡法進(jìn)行分析。

采用(C)環(huán)己酰亞胺（CHX）處理法檢測DISP的穩定性重量和DISPCS沒(méi)有或存在SHH的蛋白質(zhì)。分別在添加CHX后0、2、4、6、8和12 h采集樣品。western blot檢測DISP-HA和a-Tub蛋白水平。(C0)DISP-HA蛋白的密度定量顯示歸一化為a-Tub。數據顯示為3個(gè)生物重復的平均± SD。

（D-G）內源性AP2和穩定表達的WT orCS DISP的代表性圖像見(jiàn)DISP科mef文件。這些是用于共定位分析的數據集的代表性圖像0.在控制條件下，AP2（品紅）和WT或CSDISP-HA（綠色）顯示中等頻率的共定位（D和E，箭頭）。在表達shh的WT DISP-HA細胞中，HA和AP2的共定位增加，而在CS細胞中沒(méi)有增加（F和G，箭頭）。

（H-M）內源性?xún)韧虡擞浳锖头€定表達的DISP的代表性圖像如圖所示。箭頭指向帶有多個(gè)細胞的圖像中表達shh的細胞。

(N)在Disp中表達的V5-DISP-HA蛋白的細胞表面生物素化科顯示了mef。驅動(dòng)蛋白是加載控制件。取3個(gè)單獨實(shí)驗的密度分析的平均值，以確定細胞表面與細胞內DISP蛋白的比例（洗脫：裂解液[HA]）。

(O) Disp科將穩定表達Shh或空載體對照的mef瞬時(shí)轉染V5-Disp-HA表達載體，然后與SHH light II報告細胞共培養。熒光素酶報告基因活性歸一化為tk-腎，活性相對于Disp科MEF空向量控制（設置為1）。重復進(jìn)行三次檢測，所有數據合并。誤差條表示SD。顯著(zhù)性由單因素方差分析確定。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，ns =不顯著(zhù)。

S4。在發(fā)育中的小鼠神經(jīng)管中存在長(cháng)時(shí)間的細胞延伸，與圖5相關(guān)

（A-C）E10.5腹側神經(jīng)管用抗GFP（綠色）和抗shh（洋紅）免疫染色進(jìn)行共定位分析，DAPI為藍色，F-actin為紅色。. (A)什+/+腹側神經(jīng)管在脊索（NC）和FP內具有較強的抗shh信號，而非特異性背景抗GFP信號較低。所有體內定量均采用抗shh信號。(B–B ”0)SHH中SHH和GFP信號的共定位GFP/+胚胎(B)0)插入放大顯示在一個(gè)小的f-肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性管腔延伸的頂端（箭頭）。

(C)小提琴圖顯示了抗Shh和抗GFP信號的%信號共定位的小提琴圖+/+, ShhGFP/+, ShhGFP/GFP胚胎切片。點(diǎn)代表從2 Shh中分析的單個(gè)部分+/+, 3 ShhGFP/+和3 ShhGFP/GFP晶胚

一個(gè)矢狀平分的Disp1的(D)掃描電鏡印第安納州/+E9.5胚胎暴露神經(jīng)管腔（NTL）、FP和鄰近的NC。

(E)Disp1的掃描電鏡英德?tīng)?/span>NTL從相鄰細胞之間延伸的部分（綠色箭頭）。

（下頁(yè)繼續圖例）

                     （FandG）(F)磁盤(pán)1的掃描電鏡+/+(G) Disp1英德?tīng)?/span>胚胎神經(jīng)管腔和FP細胞。虛線(xiàn)表示管腔和暴露的FP之間的劃分。在這兩種基因型中，從FP延伸到管腔（綠色箭頭）。連接相鄰FP細胞的長(cháng)延伸的例子用黑色箭頭表示。黃色箭頭表示沿著(zhù)延伸處可以看到的凸起。

(H)散點(diǎn)圖顯示了所指示基因型的神經(jīng)管腔內的平均延伸密度。點(diǎn)表示所分析的單個(gè)掃描電鏡顯微圖。

(I)E9.5/25體scre的三維渲染；Rosa26mT/mG胚胎神經(jīng)管腔顯示shh標記的細胞素（黃色）來(lái)自memgfp標記的FP（綠色）。shh陽(yáng)性的細胞素顯示與ARL13B（青色）標記的初級纖毛接觸。f-肌動(dòng)蛋白用洋紅色表示。

(I0)顯示了單個(gè)細胞素接觸初級纖毛的痕跡。

(J)顯示了一個(gè)shh陽(yáng)性細胞素接觸接收細胞初級纖毛的單焦平面。SHH點(diǎn)(J0與arl13b標記的初級纖毛(J00箭84個(gè)與初級纖毛接觸的fp衍生延伸物中有39個(gè)（46.4%）含有SHH。參見(jiàn)視頻S2。

(K–L0)從E9.5 Disp1中提取的單個(gè)SBF-SEM切片CS/INDEL(K)和Disp1英德?tīng)?/span>(L)胚胎顯示為神經(jīng)管FP細胞。膜泡顯示在縮放圖像中(K0）和（L0)（用藍色突出顯示）。

(M)圖5K和圖5L中的神經(jīng)管的三維體積渲染顯示了從腹側到背側的角度。A，前，P，后，見(jiàn)視頻S4。. 數據以平均±SD顯著(zhù)性以**p < 0.01表示，****p < 0.0001表示，ns =不顯著(zhù)。.

S5。長(cháng)細胞延伸連接脊索與FP和周?chē)拈g充質(zhì)，與圖6相關(guān)

（Aand B）圖6C中所示的脊索的3D渲染圖，顯示了間充質(zhì)（青色）、脊索細胞（紅色）和整個(gè)脊索（灰色）。神經(jīng)管FP在(B).中顯示為綠色參見(jiàn)視頻S5。

(C–C ") E8.5/10 somiteShh-Cre; Rosa26mT/mG脊索（NC）、神經(jīng)管FP和鄰近的體細胞分別染色為F-actin（洋紅色）、GFP（綠色）、OLIG2（黃色）和DAPI（藍色）。(C0-C”)NC產(chǎn)生的GFP和肌動(dòng)蛋白陽(yáng)性延伸（箭頭）沿著(zhù)FP表面移動(dòng)，接觸相鄰的體細胞（箭頭）。

（D-F）所指示基因型的E9.5胚胎的NC和鄰近FP的F-actin染色顯示。f-actin陽(yáng)性延伸在所有基因型中都很明顯（箭頭）。

（下頁(yè)繼續圖例）  

(H)小提琴圖顯示了每個(gè)掃描步驟中f-actin陽(yáng)性擴展中自動(dòng)記錄的SHH斑點(diǎn)的總數（圖6L）。每個(gè)基因型分析n=440-796步。數據以帶有1的中位數（實(shí)線(xiàn)）表示st和 3rd四分位數（虛線(xiàn)）。

(I)Shh中抗Shh的點(diǎn)狀脊索向fp延伸的散點(diǎn)圖GFP/+;Disp1印第安納州/+,;Disp1CS/INDEL、和；Disp1英德?tīng)?/span>胚胎切片。每個(gè)基因型至少2個(gè)胚胎，每個(gè)基因型4-9個(gè)切片，被分析并以非盲的方式人工定量。數據以平均±標準差表示。顯著(zhù)性為**p < 0.01，****p < 0.0001，ns =不顯著(zhù)。

S6。肌凝蛋白10有助于細胞素的形成，與圖7相關(guān)

（A-C）顯示的具有代表性的E9.5胚胎。

（D和E）(D)WT和(E) Myo10的單個(gè)SBF-SEM切片m1J/m1J神經(jīng)管FPs與3D覆蓋的貓女追蹤延伸。顏色被任意分配，以提供與單個(gè)擴展的對比。參見(jiàn)視頻S6。

(F–G0)來(lái)自E8.5/10-12體期對照和Disp1的代表性心臟水平神經(jīng)管切片CS/INDEL對胚胎進(jìn)行OLIG2（紅色）和DAPI（藍色）染色。顯示器1CS/INDEL胚胎表現出與Myo10相似的OLIG2腹側轉移和丟失的趨勢m1J/m1J胚胎（圖7G)。

(H)Segmentedbargraphshowingtheproportionofcardiacleveltissuesectionswithnormal, ventrallyshifted, orabsentOLIG2stainingfromcontrolandDisp1CS/INDEL晶胚每個(gè)基因型有n = 3個(gè)胚胎，每個(gè)胚胎有6-15個(gè)切片，共分析27-35個(gè)切片。

(I)E9.5WT胚胎的3D渲染顯示了用F-actin染色的神經(jīng)管頂板。f-actin陽(yáng)性延伸從頂板和背側神經(jīng)管延伸到管腔（黃色箭頭）。

(J)Myo10中的細胞素發(fā)生率+/+（淺灰色）或Myo10-/-（深灰色）mef表達指示的熒光標記信號蛋白或GFP對照顯示。數據以平均±標準差表示。以*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001，ns =不顯著(zhù)。

圖S7。Myo10RNA-seq分析m1J/m1JE8.5/8-10體細胞期胚胎，與圖7相關(guān)

(A)這是一個(gè)火山的原木圖10的價(jià)值。日志2Myo10中mRNA表達的比值倍變化m1J/m1J胚胎與Myo10比較+/+胚胎(n = 4為Myo10+/+Myo10m1J/m1J).p<為0.05和log的基因2比值>0.5（右上象限）或<-0.5（左上象限）顯示。對Myo10進(jìn)行了GSEA檢測m1J/m1J胚胎與Myo10比較+/+.

(B)在Myo10中負向富集的生物過(guò)程、分子功能和細胞成分的前4個(gè)基因本體術(shù)語(yǔ)m1J/m1J胚胎代表。

（C-E）富含(C)標志、(D)京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）和(E)Myo10生成的Wiki信號通路m1J/m1J胚胎超過(guò)Myo10+/+(p < 0.001).Myo10的負富集m1J/m1J刺猬信號圖(C0)來(lái)自標志數據庫、軸突引導和Notch信號通路(D0和D00)，來(lái)自KEGG數據庫和Wnt信號通路(E0)，來(lái)自Wiki路徑數據庫。